链球菌荚膜多糖的纯化制造技术

一种无乳链球菌荚膜多糖的纯化方法，其中首先用醇类和钙盐的水性混合物处理糖，然后用阳离子去污剂沉淀。该方法可在３天内完成，产率约为６０％。其无需ＤＮＡ酶、ＲＮＡ酶和／或蛋白酶处理。该方法获得的糖中蛋白质污染极低并且２８０ｎｍ的吸光度极低。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及纯化细菌荚膜多糖的领域，特别是无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)的那些荚膜多糖，特别是制备疫苗所用的荚膜多糖。
技术介绍
细菌荚膜糖已用于抗有荚膜细菌的疫苗多年。然而，由于糖是不依赖T细胞的抗原，它们的免疫原性不佳。与运载体缀合能将不依赖T的抗原转化成依赖T的抗原，从而增强记忆反应并产生保护性免疫力。因此，最有效的糖疫苗以糖缀合物为基础，原型缀合物疫苗能抵御乙型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(“Hib”)。 已描述其缀合物疫苗的另一种细菌是无乳链球菌，也称为“B群链球菌”，或简称为“GBS”。Dennis Kasper及同事从事了该项工作的大部分，见例如参考文献1-9的文件。 糖疫苗的起点是糖自身，它通常纯化自靶细菌。参考文献2和10详述了纯化GBS糖的Kasper方法，该方法包括细菌培养后的以下基本步骤过滤除菌；用10kDa截断值的膜超滤；加入乙醇至含量为30％以沉淀污染物；将乙醇含量增加至80％过夜沉淀GBS糖；收集干燥沉淀物；依次用RNA酶、DNA酶和链霉蛋白酶处理；用氢氧化钠处理；透析；DEAE-Sephacel离子交换层析；透析；冻干；乙酸酐处理；刀豆球蛋白(conconavilin)亲和层析除去甘露聚糖；Ultragel尺寸排阻层析；和最终的冻干。 该方法非常慢，其中RNA酶、DNA酶、链霉蛋白酶和氢氧化钠处理均持续过夜，完成该方法要一星期以上。此外，该方法的产率低于50％。因此，需要其它的改进方法来纯化GBS荚膜多糖，特别是速度较快而产率较高的方法。 专利技术内容 本专利技术涉及一种纯化方法，该方法首先用醇类(例如，乙醇)和金属阳离子(例如，钙盐)的水性混合物处理糖，然后用阳离子去污剂(例如，CTAB)沉淀。糖从细菌释放后，该方法可以在3天内完成，产率约60％。 本专利技术提供纯化无乳链球菌荚膜多糖的方法，包括以下步骤(a)用水性金属阳离子和醇类处理含有链球菌蛋白、核酸和荚膜多糖的混悬液以沉淀核酸和蛋白质；(b)分离沉淀的物质与水性物质；和(c)用阳离子去污剂处理水性物质以沉淀荚膜多糖。然后可分离并再溶解沉淀的多糖用于随后的疫苗制备。该方法可以包括其它加工步骤，例如超滤以除去低分子量污染物(例如群特异性的碳水化合物片段)，额外的沉淀和再溶解和/或干燥步骤。 本专利技术还提供纯化无乳链球菌荚膜多糖的方法，包括用阳离子去污剂沉淀糖的步骤。类似地，本专利技术对纯化无乳链球菌荚膜多糖的方法提供改进，包括用阳离子去污剂沉淀糖。用阳离子去污剂沉淀简化了荚膜糖与存在的其它糖(例如群特异性糖)的分离。 本专利技术还提供纯化无乳链球菌荚膜多糖的方法，其包括采用沉淀来除去污染性核酸和/或蛋白质的步骤。类似地，本专利技术对纯化无乳链球菌荚膜多糖的方法提供改进，包括采用沉淀来除去污染性核酸。沉淀避免了DNA酶或RNA酶处理的使用。 本专利技术还提供纯化无乳链球菌荚膜多糖的方法，其中该方法不包括DNA酶处理的步骤。类似地，本专利技术提供纯化无乳链球菌荚膜多糖的方法，其中该方法不包括RNA酶处理的步骤。类似地，本专利技术提供纯化无乳链球菌荚膜多糖的方法，其中该方法不包括蛋白酶处理的步骤。本专利技术方法最好不包括利用DNA酶、RNA酶和/或蛋白酶中的两种或三种，例如一种也不用。 本专利技术还提供纯化无乳链球菌细菌荚膜糖的方法，其中该方法的产率(始于细菌，终于荚膜多糖)至少有40％(例如，>50％、>60％、>70％、>80％、>90％)。实践的局限性提示该产率不会超过90％(例如，可能<90％、<80％、<70％等)。 本专利技术还提供纯化无乳链球菌细菌荚膜糖的方法，其中该方法提供含糖的组合物，与组合物中糖、蛋白质和核酸的总重相比，所述糖的纯度至少有89％(例如，≥90％、≥92％、≥94％、≥96％、≥98％等)。 本专利技术还提供纯化无乳链球菌细菌荚膜糖的方法，其中(a)该方法的产率至少有40％(如上所述)和(b)糖的纯度至少有89％(如上所述)。 本专利技术还提供从无乳链球菌细菌中释放荚膜多糖的方法，包括用II型磷酸二酯酶处理细菌的步骤。这些酶与氢氧化钠一样能切割相同的磷酸酯(键)，但其优点是不会有氢氧化钠的脱-乙酰化反应性。 本专利技术还提供含无乳链球菌荚膜多糖的组合物，其中280nm的紫外吸光度小于0.20。优选吸光度<0.15或者甚至<0.10。发现本专利技术方法能得到蛋白质污染极低的组合物，从而使得280nm吸光度极低。这特别优于现有的方法，其得到的物质在约280nm显示有吸光度峰。 本专利技术还提供含无乳链球菌荚膜多糖的组合物，其中280nm紫外吸光度与260nm紫外吸光度之比大于0.85。优选>0.90、>0.95或者甚至>1.0的比例。该比例通常小于1.2。优选1.0±0.1的比例。 本专利技术还提供含无乳链球菌荚膜多糖的组合物，其中该组合物在220nm-300nm之间的紫外吸光度光谱在约270nm处显示肩峰或峰值。本专利技术还提供含无乳链球菌血清型Ia或血清型III荚膜多糖的组合物，其中250nm-275nm之间的紫外吸光度光谱未增加。本专利技术还提供含无乳链球菌荚膜多糖的组合物，其中该组合物在250nm-275nm之间的紫外光谱既无最大值也无拐点。 本专利技术还提供含无乳链球菌荚膜糖的组合物，其中与组合物中糖、蛋白质和核酸的总重相比，所述糖的纯度至少有89％(例如，≥90％、≥92％、≥94％、≥96％、≥98％等)。 本专利技术还提供含无乳链球菌血清型Ia荚膜糖的组合物，其中所述糖具有单糖亚单位，其中不超过93％(例如，≤92％、≤90％、≤85％、≤80％、≤75％、≤70％、≤65％、≤60％、≤55％、≤50％、≤45％、≤40％等)的所述单糖亚单位具有N-乙酰基。 本专利技术还提供含无乳链球菌血清型Ib荚膜糖的组合物，其中所述糖具有单糖亚单位，其中至少有78％(例如，≥80％、≥85％、≥90％、≥92％、≥94％、≥96％、≥98％等)的所述单糖亚单位具有N-乙酰基。 本专利技术还提供含无乳链球菌血清型III荚膜糖的组合物，其中所述糖具有单糖亚单位，其中不超过76％(例如，≤74％、≤72％、≤70％、≤65％、≤60％、≤55％、≤50％、≤45％、≤40％等)的所述单糖亚单位具有N-乙酰基。 本专利技术还提供含无乳链球菌血清型Ia荚膜糖的组合物，其中所述糖的分子量至少为100kDa。 本专利技术还提供含无乳链球菌血清型Ib荚膜糖的组合物，其中所述糖的分子量至少为40kDa。 本专利技术还提供含无乳链球菌血清型III荚膜糖的组合物，其中所述糖的分子量至少为40kDa。 荚膜糖 无乳链球菌荚膜多糖与细菌肽聚糖骨架中的GlcNAc残基共价相连，其不同于B群抗原，该抗原是与同一肽聚糖骨架上的MurNAc残基相连的另一种糖(附图说明图1)。不同血清型的荚膜多糖在化学上相关，但在抗原性上极为不同。所有GBS荚膜多糖共有以下三糖核心β-D-GlcpNAc(1→3)β-D-Galp(1→4)β-D-Glcp。 各种GBS血清型的区别在于该核心得到修饰。例如，该核心是用GlcNAc(Ia)还是用Gal(III)来连接连续的三糖本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纯化无乳链球菌荚膜多糖的方法，包括以下步骤：（ａ）用水性金属阳离子和醇类处理含有链球菌蛋白、核酸和荚膜多糖的混悬液以沉淀核酸和蛋白质；（ｂ）分离沉淀的物质与水性物质；和（ｃ）用阳离子去污剂处理水性物质以沉淀荚膜多糖。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：P科斯坦蒂诺，
申请(专利权)人：诺华疫苗和诊断有限公司，
类型：发明
国别省市：IT[意大利]