本发明专利技术涉及生物领域。新型胰岛素衍生物，其特征是：其化合物通式为Ｃ↓［ｎ］Ｈ↓［２ｎ＋１］ＮＨ－Ｘ－Ｄ，式中ｎ＝１４－２２，Ｃ↓［ｎ］Ｈ↓［２ｎ＋１］ＮＨ为直链饱和脂肪氨基；Ｘ为遗传编码的脯氨酸以外的天然氨基酸或者一氨基一羧基的非天然氨基酸；Ｄ为脱去Ｂ３０氨基酸残基的天然猪胰岛素或脱去Ｂ３０氨基酸残基的人胰岛素。本发明专利技术胰岛素衍生物是在天然胰岛素或其类似物母体Ｂ链的Ｃ末端残基的α－羧基上连接一条脂肪链所形成的新型衍生物。其做法是以天然的猪胰岛素或人胰岛素为起始原料，使用羧肽酶Ａ将上述胰岛素Ｂ链Ｃ末端第一个氨基酸残基切掉，然后胰蛋白酶为催化剂，将一个连有脂肪链的氨基酸衍生物通过酶促反应成为Ｂ链Ｃ末端上连接了脂肪链的新型胰岛素衍生物。该衍生物具有潜在的口服功能及长效功能。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药领域，特别是涉及糖尿病用胰岛素，另外还提供其制 备方法。二
技术介绍
糖尿病是一种常见的多发性代谢疾病，国内外的发病率均呈上升趋势。据不完全统计，全国现有糖尿病患者3000万人以上，糖尿病的发病率高达3.2%。 虽然许多疾病都能导致人死亡，但糖尿病是引起人死亡的第三位的主要原因。胰岛素是治疗糖尿病的特效多肽激素化合物，迄今为止尚无更有效的替代 药物。但是，由于胰岛素是一种蛋白质，容易被胃肠道中的蛋白酶水解而失去 活性，因此只能注射使用，不能够以其他方式给药。对于胰岛素依赖型的病人 来说，要维持生命的正常代谢，必须频繁注射用药，这就给该类病人带来极大 痛苦和不便。为了解决给要困难，延缓胰岛素在体内的降解和排泄，近年来国内外对胰 岛素的新剂型开展了广泛研究，化学修饰的方法是制备胰岛素新剂型的重要研 究课题之一。对于糖尿病的病人来说，有效的治疗方法涉及两种外源胰岛素的应用，饮 食使用的速效胰岛素和长效的基础胰岛素。目前胰岛素衍生物的长效机理基本上分为三种第一种是改造胰岛素的一级结构的氨基酸序列，使之形成不溶的多聚体晶 态，利用这种不溶态在体内的缓慢释放，来达到长效作用；第二种是用化学修饰的方法在胰岛素的某一个氨基酸残基的侧链上共价 结合一条脂肪链，通过连接的脂肪链在体内与白蛋白的作用增加循环半寿期来 达到长效；第三种就是通过化学方法在胰岛素的某些氨基酸残基的官能团上连接一 条或数条高分子物质，以增加胰岛素的循环半寿期而达到长效的目的。采取上述第一种长效机理的胰岛素制剂的代表是Ultralente， Lente，和 半-Lente。但现已表明这些长效制剂的不溶性会引起剂量反应的不一致，以及 在所述时间作用方面不可预测的问题，导致了血糖控制的不稳定，从而容易产 生危及生命的低血糖症状，因此仍需要可溶的长效基础胰岛素以得到成功的强 胰岛素替代疗法。用脂肪链修饰胰岛素的方法，人们进行了许多研究。通常的办法是使用活 化的脂肪酸修饰胰岛素的N-末端氨基或e -氨基，称之为酰化胰岛素。由于胰 岛素(猪，人)具有三个可被修饰的氨基A1-Na， B1-Na， B29-N e 。因此 脂肪酸修饰的只能是这三个氨基。Muranishi和Kiso (日本专利申请1-254699)公开了猪，牛，人胰岛素的 酰化，具体公开了下列化合物B29- Ne—棕榈酰胰岛素和B1，B29- Na， N e -二棕榈酰胰岛素。Hashimoto 等人在药理学研究 (Pharmaceutical Research ) 6: 171 176(1989)中报道了Bl-Na-棕榈酰胰岛素(N末端的a氨基被酰化)和Bl， B29的二酰化胰岛 素。Hashimoto的研究表明Bl-N a -—棕榈酰胰岛素只在高剂量时有降血糖作 用，而B1，B29- Ncc， Ne-二棕榈酰胰岛素基本无降血糖作用。丹麦的诺和诺德公司的B29-e-N单酰化胰岛素具有较好的降血糖作用， 并已上市，商品名在国内叫做"地特胰岛素"。这说明，只有B29- Ne的单修 饰胰岛素才有可利用的降糖活性，但根据该药物的专利，使用特别方法修饰胰' 岛素，得到的B29- Ne单酰化胰岛素的产率也只有73%，而且分离起来比较困 难。迄今为止，胰岛素的脂肪链修饰仅限于修饰侧链或N末端氨基，还没有人 进行过羧基修饰，并得到超过80%的产率的单一修饰物。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服上述不足问题，提供一种新型胰岛素衍生物，是经化 学修饰胰岛素，另外还其供新型胰岛素衍生物的制备方法，酶促合成，胰岛素' 与所要修饰的化学基团的连接是位点专一的和高效的。本专利技术为实现上述目的所采用的技术方案是其化合物通式为C H2n+1NH-X-D，式中n-14-22， CnH2n+1NH为直链饱和脂肪氨基；X为遗传编码的 脯氨酸以外的天然氨基酸或者一氨基一羧基的非天然氨基酸；D为脱去B30 氨基酸残基的天然猪胰岛素或脱去B30氨基酸残基的人胰岛素。 所述X为苏氨酸。所述CnH2n+1NH与X的羧基之间为酰胺键连接；X的氨基与D的C末端B29 赖氨酸的羧基之间是酰胺键连接。 ' 本专利技术新型胰岛素衍生物的制备方法，具体合成步骤为第一步脂肪胺的制备将一定量的通式为CnH2 +10H的直连饱和脂肪醇(n=14-22)加入到甲苯中，加热共沸除去水分，余下的溶液加入与脂肪醇等 摩尔量的吡啶，回流反应并滴加2倍脂肪醇摩尔量的氯化亚砜(S0C12)，滴加 完毕后再于80°C反应2-6小时，冷却过滤除去结晶物，然后减压蒸馏除去甲 苯，得到的产物为CnH2n+1Cl，将该物质放入反应釜中，以少量无水甲醇溶解， 然后加入过量的液态氨，密闭下60°C反应12-24小时，开釜后减压除去过量 的氨和甲醇，得到通式为CUH2的脂肪胺(n=14-22)，备用；第二步CnH2n+1NH-X的制备:取一定量的氨基用Fmoc保护了的氨基酸衍生物， 其化学通式为Fmoc-HN-X-(COOH)， X为氨基酸残基，溶于二氯甲烷(CH2C12) 与二甲基甲酰胺(DMF)的混合溶液中，加入Fmoc-HN-X-(COOH)等摩尔量的备 用的aUH2，再加入2倍Fmoc-HN-X-(C00H)摩尔量的碳二亚胺(DCC)， 0-10 °(:搅拌反应12-24小时，然后过滤除去副产物DCU，得到的溶液中加入过量的 哌啶，搅拌反应脱掉Fmoc保护基，得到CnH2n+1NH-X，备用，此时X的羧基与脂 肪胺形成酰胺连接，氨基为游离状态； '第三步去掉B30氨基酸残基的胰岛素中间体D的制备在PH8. 3的碳酸氢 铵溶液中加入天然的猪胰岛素或人胰岛素，使之溶解，然后加入催化量的羧肽 酶A，在37。C水浴中作用2小时，然后加酸终止反应，反应液用S印hadexG50 分离，冻干，得到脱掉B30氨基酸的胰岛素中间体，其B链N末端为B29-Lys， 备用；第四步新型胰岛素衍生物的制备首先将一定量备用的脱掉B30氨基酸残 基的胰岛素中间体用0.5-2N的醋酸溶液溶解，得溶液1;然后将备用的 C凡^NH-X溶于无水乙醇与二甲基甲酰胺(Et0H /画F )的1: 1-1: 6体比积混合溶液中，得溶液2，原料胰岛素中间体与CnH2n+1NH-X的摩尔比为1:20-1:100;最后溶液1和2合并并调节pH至6-7，加入催化量的胰蛋白酶，在20-35°C的水浴中反应12-24小时，即可得到本专利技术的终产物一B30的氨基酸残基的羧基被脂肪胺修饰的新型胰岛素衍生物。所述第一步脂肪胺的制备中滴加吡啶完毕后反应时间为4小时。 所述第一步脂肪胺的制备中加入液态氨反应时间为18小时。 所述第二步CnH2n+lNH-X的制备反应温度为4°C，反应时间为18小时。 所述第四步新型胰岛素衍生物的制备中溶解脱掉B30氨基酸残基的胰岛素中间体的醋酸溶液浓度为1N。所述第四步新型胰岛素衍生物的制备中原料胰岛素中间体与CJk"NH-X的摩尔比为1:60。所述第四步新型胰岛素衍生物的制备中溶液1和2合并并调节pH值为6. 8。 本专利技术胰岛素衍生物是在天然胰岛素或其类似物母体B链的C末端残基的 a -羧基上连接一条脂肪链所形成的新型衍生物。其做法是以天然的猪胰岛素 或人胰岛素为起始原料，使用羧肽酶A在适当的本文档来自技高网...
【技术保护点】
新型胰岛素衍生物，其特征是：其化合物通式为Ｃ↓［ｎ］Ｈ↓［２ｎ＋１］ＮＨ－Ｘ－Ｄ，式中ｎ＝１４－２２，Ｃ↓［ｎ］Ｈ↓［２ｎ＋１］ＮＨ为直链饱和脂肪氨基；Ｘ为遗传编码的脯氨酸以外的天然氨基酸或者一氨基一羧基的非天然氨基酸；Ｄ为脱去Ｂ３０氨基酸残基的天然猪胰岛素或脱去Ｂ３０氨基酸残基的人胰岛素。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：何明磊，
申请(专利权)人：大连民族学院，
类型：发明
国别省市：91[中国|大连]
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