基于树枝状聚合物的聚合酶链式反应优化方法技术

本发明专利技术公开一种生物技术领域中的基于树枝状聚合物的聚合酶链式反应优化方法，在聚合酶链式反应体系里加入树枝状聚合物材料作为添加剂优化聚合酶链式反应，所述的树枝状聚合物包括与至少两个树枝状分支共价结合的多价核，及通过至少两代扩展，使聚合度至少达到２．０的分支结构。通过对该种树枝状聚合物进行梯度稀释或浓缩，以浓度梯度方式加入到该聚合酶链式反应体系中，以实际扩增达到优化目的的范围为所需该树枝状聚合物的有效用量范围。本发明专利技术具有优化扩增的效果显著，添加剂成本低廉，易于保存，应用广泛的优点。扩增产物的特异性得到显著提高，在某些反应中产物的产量也得到明显的提高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及的是一种生物
中的反应方法，特别是一种基于树枝状 聚合物的聚合酶链式反应优化方法。
技术介绍
聚合酶链式反应(PCR)是一种在体外模拟自然DNA复制的核酸扩增技术。PCR 技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷 酸引物。PCR主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成， 每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人 工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2"的指数形式迅速 扩增，经过25 30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上。PCR技术因其特异性高、灵敏度高、简单快速、对样本的纯度要求低、可定 量模板数等优点，在生物科学众多领域的应用日趋广泛。但实际操作中，进行 PCR扩增仍旧存在一些需要改进的问题，如特异性、灵敏度、反应速度等问题。 最突出的问题就是PCR扩增存在不同程度的非特异性。PCR作为一种体外模拟的 DNA链式扩增反应，机制非常复杂，在链式反应过程中总是会发生一定程度的干 扰副反应，如引物模板可能错配、引物结合形成二聚体等引起的扩增等等。科 学家们从不同的角度来尝试解决这个问题，如从模板、引物、Mg2+浓度、退火 温度等角度改善其特异性，或者将增效剂如甲酰胺、甘油、二甲基亚砜，甜菜 碱、氯化四甲基铵等引入PCR体系。但是在实际应用过程中，有些效果却不尽 如人意，甚至会抑制PCR的扩增过程。经对现有技术文献的检索发现，美国专利US PATENT 5， 646， 019公开了 "一 种利于引发扩增核酸模板的制备方法"，该方法是在PCR体系里加入了耐热的 单链结合蛋白(SSB， single-stranded nucleic acid binding protein) ， SSB 蛋白只结合单链DNA，但不结合双链DNA，通过结合并抑制含有单链的非特异性片段的扩增，从而实现了 PCR扩增的优化。由于提取纯化SSB蛋白技术复杂， 试剂纯度也要求很髙，导致制备成本非常高，商品化试剂盒非常昂贵，价格是 常规PCR试剂的6-7倍；同时为了保持单链结合蛋白的生物活性，要求严格贮 存于—2(TC，并且其生物活性保持期限较短。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种基于树枝状聚合物的聚合酶链式反 应优化方法，使其提高PCR反应的扩增特异性和目标DNA的产量，同时不引起 成本的明显增高。本专利技术通过将有效量的树枝状聚合物材料添加到聚合酶链式 反应体系中进行PCR反应，达到增加PCR反应的特异性，提高PCR目标产物的 产量的效果。同时，由于树枝状聚合物成本低廉，易于保存，相比于其他生物 分子添加材料SSB等成本大大降低。本专利技术是通过以下技术方案实现的，本专利技术在聚合酶链式反应体系里加入 树枝状聚合物材料作为添加剂优化聚合酶链式反应。所述的树枝状聚合物包括与至少两个树枝状分支共价结合的多价核，及通 过至少两代扩展，使聚合度至少达到2.0 (>G2)的分支结构。原则上，所有的树枝状聚合物均适用于本专利技术。树枝状聚合物(行业内公 认称之为dendrimer)代表一类树枝状结构的三维大分子，其具有明确定义的几 何形状和化学结构。这类分子的分枝从一核心或一中心向具有官能团的外围辐 射，内部具有广阔的空腔，具有非常高的表面密度和有序化程度，很容易进行 官能化。适合的树枝状聚合物实例见Angew. Chem. Int. Ed. Engl， 1990， 29 (2)第138—175页所述。合适的树枝状聚合物包括具有完善支化结构的树枝状聚合物以及在分支结 构中有缺陷的树枝状聚合物，本专利技术中优选的是对称支化的树枝状聚合物。所述的树枝状聚合物优选含有氨基末端端基基团的树枝状聚合物。根据聚 合度的增加，聚合物的末端氨基基团呈指数增长，即末端氨基基团数=2 (J^s+2)。所述树枝状聚合物的氨基末端基团上，可以部分或全部连接上各种修饰官 能基团，优选来自下列基团的修饰基团乙酰基、羧酸基、羟基。末端基团的 修饰方法是公知的，可以通过使最后一级的氨基端基全部或部分与合适的反应 剂反应来获得。所述的树枝状聚合物是聚酰胺一胺型或聚丙烯亚胺型dendrimer。其中聚酰 胺一胺型聚合物是以乙二胺或丁二胺为核生长的。本专利技术优选的是基于乙二胺 核的聚酰胺一胺型(PAMAM) dendrimer。所述基于乙二胺核的聚酰胺—胺型树枝状聚合物为水溶液，可以自制聚合 度为1.0到10.0的样品，目前其制备方法是公知的，具体制法可参见文献 (Macromolecules， 1986， 19， 2466; Angew. Chem. Int. Ed. Engl， 1993， 32(9)， 1306)，末端基团的修饰方法是公知的。例如，乙酰基修饰dendrimer末端氨基 的反应为所述基于乙二胺核的聚酰胺一胺型树枝状聚合物的聚合度以3.0到8.0 (G3 G8)为佳，优选聚合度4.0或5.0 (G4或G》的聚酰胺一胺型dendrimer。 下述化学式显示聚合度为4. 0的聚酰胺一胺型dendrimer。<formula>complex formula see original document page 8</formula>在实际应用中，将有效量的树枝状聚合物材料作为添加剂加入到聚合酶链 式反应体系中进行PCR反应。所述有效量是指产生优化作用的有效用量范围。 针对树枝状聚合物材料聚合度不同、末端端基不同，聚合酶链式反应体系不同， 产生优化作用的所需添加的该树枝状聚合物有效用量范围是不同的。本领域技 术人员可以方便地通过下述方法来实验得出有效用量针对不同聚合酶链式反应体系，不同端基和聚合度的树枝状聚合物产生优 化作用的有效用量范围通过以下方法进行确定通过对该种树枝状聚合物进行 梯度稀释或浓缩，以浓度梯度方式加入到该聚合酶链式反应体系中，以实际扩 增达到优化目的的范围为所需该树枝状聚合物的有效用量范围。所述聚合酶链式反应体系可以是那些容易产生非特异性扩增的体系、GC含 量高的扩增体系、模板数为低拷贝(小于103)的体系、复杂基因背景体系或包 含上述数种因素的体系。例如，产生非特异性扩增的PCR再扩增体系可以作为一个典型的体系。PCR 再扩增体系是指以第一次扩增的产物稀释后作为第二次扩增的模板，进行第二 次扩增。当以第一次扩增的产物稀释1000倍作为第二次扩增的模板，且在常规PCR扩增体系下进行扩增时，会产生大量的非特异性扩增产物，而如果在该PCR体系中加入适量的特定末端端基的树枝状聚合物材料，则能够消除这些非特异性扩增，在琼脂糖凝胶电泳图上得到单一的目标产物；所述聚合酶链式反应体系也可以是采用pfu DNA聚合酶的扩增体系。所述的PCR体系的一般组成成份见于各种常用分子生物学工具书或各种商业聚合酶说明书。以Takara公司Ex Taq酶为例， 一个PCR扩增反应的组成为<table>complex table see original document page 9</column></row><table>所述的PCR反应的一般过程为:(1) 制备PCR反应体系本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于树枝状聚合物的聚合酶链式反应优化方法，其特征在于，在聚合酶链式反应体系里加入树枝状聚合物材料作为添加剂优化聚合酶链式反应，所述的树枝状聚合物包括与至少两个树枝状分支共价结合的多价核，及通过至少两代扩展，使聚合度至少达到２．０的分支结构。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曹雪雁，杨文超，张晓东，李鑫辉，胡钧，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]