新颖的杆菌mHKcel纤维素酶制造技术

本发明专利技术提供了被命名为ｍＨＫｃｅｌ的新颖的纤维素酶核酸序列，和相应的ｍＨＫｃｅｌ氨基酸序列。本发明专利技术也提供了包括编码ｍＨＫｃｅｌ核酸序列的表达载体和宿主细胞，重组的ｍＨＫｃｅｌ蛋白，以及制备它们的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种新的纤维素酶，在此被称作mHKcel。本专利技术 也描述了编码该纤维素酶的核酸，包含所述纤维素酶的组合物，鉴定 新的纤维素酶的方法，和应用所述组合物的方法。优选地，纤维素酶 是从杆菌属，优选地是凡agara^w^w被分离出来的。本专利技术进一 步涉及新的纤维素酶在组合物中的应用，在本领域中，认为所述组合 物中被添加了纤维素酶，而具有优势，所述应用包括，作为去污剂组 合物中的添加剂，用在含纤维素织物的处理中，用在纸浆和纸的处理 中，以及用在淀粉的处理中，用于生产高果糖玉米浆或者乙醇。
技术介绍
纤维素(Cellulose)和半纤维素(hemicellulose)是由光合作 用生成的最丰富的植物材料。它们可以被许多微生物降解并用作能量 来源，这包括细菌、酵母和真菌，它们产生能够将多聚物底物水解为 单体糖的胞外酶(Aroetal.，2001)。由于不可再生资源途径的限制，纤 维素成为主要的可再生能源的潜力是巨大的(Krishnaeta1.，2001)。通 过生物学方法有效利用纤维素，是解决食品、词料和燃料短缺的一个 途径(Ohmiyaeta1.,1997)。纤维素酶(Cellulases)是水解纤维素(/5-1，4葡聚糖或者 糖苷键)导致形成葡萄糖、纤维二糖、纤维寡糖(cdlooligosaccharides) 和类似物质的酶。纤维素酶在传统上被分为三个主要类型内切葡聚 糖酶(endoglucanases ) (EC 3.2丄4) ( "EG")， 外切葡聚糖酶(exoglucanases)或者纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91) ("CBH")和/5-葡萄糖苷酶([间-D-glucoside glucohydrolase; EC 3.2.1.21)("BG")。(Knowles et al.， 1987; Shuldn, 1988)。内切葡聚糖酶主要作用于纤维 素纤维的非晶体部分，而纤维二糖水解酶也可以降解晶体纤维素(Nevalainen and Penttila, 1995)。因此，纤维二糖水解酶在纤维素酶 系统中的存在对于晶体纤维素的有效溶解是必需的(Suumakki， et al. 2000)。 /5-葡萄糖苷酶的作用是从纤维二糖、纤维寡糖和其它糖苷释放 出D-葡萄糖单位(Freer, 1993)。为了有效地将晶体纤维素转变为葡萄糖，完整的纤维素酶系 统是必需的，其包括来自CBH、 EG和BG类别中每一类的成分，而 孤立的成分在水解晶体纤维素方面的有效性较小(Filhoetal.， 1996)。 已经观察到，在不同类别的纤维素成分之间存在协同关系。特别地， EG-型纤维素酶和CBH-型纤维素酶协同地相互作用，以更加有效地降 解纤维素。参见，例如，Wood, 1985。 尽管纤维素酶组合物在之前已被描述过，但仍存在着对新的 和改进的纤维素酶组合物的需求，它们将用于家用洗涤剂、石磨洗组 合物(stonewashing compositions)或者洗衣店f先涤剂，等等。显示出 改进的性能的纤维素酶是特别有价值的。专利技术概述 本专利技术的一个目的是，提供新的纤维素酶，其具有用于洗涤齐lj，处理织物，生物质转化和制造纸浆以及纸的有益性质。本专利技术的一个目的是，提供有纤维水解活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸。所述多肽可以改进细胞壁物质，例如纤维素和域者半纤维素的降解。这些多肽也可以改进参与植物细胞壁物质例如，生物材料降解的其它酶的稳定性或者活性。本专利技术的一个目的是，提供新的纤维素酶及其衍生物，生产这样的纤维素酶的方法，和含有这种新的纤维素酶的组合物。本专利技术 进一步涉及在组合物中应用新的纤维素酶及其衍生物，在本领域中， 认为所述组合物中被添加了纤维素酶，而具有优势，所述应用包括， 作为去污剂组合物中的添加剂，用于处理织物，如含纤维素织物和对 其有用的纤维，作为动物饲料添加剂，在生物量转化中，在用于处理 纸浆和纸，以及用在淀粉的处理中，用于生产高果糖含量的玉米浆或 者乙醇。 本专利技术的又一个目的是，提供通过来自重组宿主细胞的异源 表达，生产新的纤维素酶的方法。 本专利技术的又进一歩的目的是，提供编码本专利技术纤维素酶的核 酸序列。在一方面，核酸和氨基酸序列有助于商业生产本专利技术的新的 纤维素酶和纤维素酶组合物。本专利技术的再进一步的目的是，提供新颖的纤维素酶，其具有极好的特性，用于洗涤剂中，处理织物，用作饲料添加剂以及用于制 造纸浆和纸中。在第一个方面，本专利技术包括具有编码mHKcel的序列的分离 的多核苷酸，与m/f《ce/基因编码序列互补的序列，和含有该多核苷 酸的组合物。多核苷酸可以是mRNA、 DNA、 cDNA、基因组DNA、 或者它们的反义类似物。 在一种实施方案中，m/a:ce/多核苷酸可以包括分离的核酸 分子，在中度至高度严紧(stringency)的条件下，该分子和被显示为 SEQIDNO : 2的核酸的互补序列杂交，其中所述核酸分子编码显示出 纤维素结合活性的mHKcel多肽。与被显示为SEQ ID NO : 2的序列具有至少80%、 85%、 90%、 95%、 98%或者更高序列同一性的多核苷酸，可以编码mHKcel 蛋白。在一种具体的实施方案中，多核苷酸包括与SEQIDN0:2基 本相同的序列。本专利技术也预期了多核苷酸的片段，优选地是长度至少 大约15-30个的核苷酸。 在第二个方面，提供了可以从杆菌(&"7/w)得到的新的纤 维素酶或其衍生物。优选地，本专利技术的纤维素酶包括，根据图3(SEQID NO:3)的氨基酸序列、片段、或者其衍生物，与其活性部分具有大于90Q/^的序列同一性，优选地，具有大于95%的序列同一性，和更优选 地，具有大于97%的序列同一性。 在第三方面，本专利技术涉及含有编码本专利技术多肽的核苷酸序列 的构建物，所述核苷酸序列和一个或者多个调控序列有效地连接，调 控序列指导多肽产物在合适的宿主中产生。 本专利技术进一步提供了重组的表达载体，其包括编码mHKcd 或者片段或者其剪接变体的核酸序列，核酸序列和调控元件有效地连 接，调控元件对于在选定的宿主中表达蛋白是有效的。在一个相关方 面，本专利技术包括含有该载体的宿主细胞。 在第四方面，本专利技术涉及含有本专利技术核酸构建物的重组表达 载体。 在第五方面，本专利技术涉及含有本专利技术核酸构建物的重组宿主 细胞。 本专利技术进一步包括，通过重组技术生成mHKcel的方法，这 是通过在可有效促进蛋白表达的条件下，培养含有编码mHKcel核酸 序列的重组原核宿主细胞或者真核宿主细胞，并随后从宿主细胞或者 细胞培养介质中回收蛋白而实施的。 在第六方面，本专利技术涉及用于生成本专利技术多肽的方法，方法 包括(a)培养微生物，以生成多肽，所述微生物在野生型形式下可 以生成多肽；和(b)回收多肽。 在第七方面，本专利技术提供了在纤维素向乙醇转变中有用的酶 组合物。在一种优选的实施方案中，酶组合物包括mHKcel。该组合 物可以进一步包括其它的纤维素酶，如内切葡聚糖酶和/或者纤维二糖 水解酶。组合物可以以mHKcd被富集。在本专利技术的一个实施方案中，提供了通过从环境中分离总微 生物群落DNA而鉴定新的酶，在大肠杆菌中构建基因组DNA文库， 筛选库中纤维素酶活性表达，在纤维本文档来自技高网...

【技术保护点】
分离的多核苷酸，选自下列：　（ａ）核酸序列，其与如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１表示的序列具有至少８５％的序列同一性，或者其互补序列；　（ｂ）核酸序列，其编码或者互补于编码ｍＨＫＣｅｌ的多肽的序列，所述多肽与图３（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）表示的氨基酸序列具有至少８５％的序列同一性；　（ｃ）核酸序列，其编码或者互补于编码ｍＨＫＣｅｌ的多肽的序列，所述多肽与图３（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）表示的氨基酸序列具有至少９０％的序列同一性；　（ｄ）核酸序列，其编码或者互补于编码ｍＨＫＣｅｌ的多肽的序列，所述多肽与图３（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）表示的氨基酸序列具有至少９５％的序列同一性；　（ｅ）核酸序列，其编码或者互补于编码ｍＨＫＣｅｌ的多肽的序列，所述多肽具有图３（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）表示的氨基酸序列；　其中所述分离的多核苷酸编码具有纤维素酶生物学活性的多肽，并且其中所述同一性是通过ＭａｃＶｅｃｔｏｒ版本６．５中的ＣＬＵＳＴＡＬ－Ｗ程序被确定的，采用缺省参数操作，包括空位开放罚分为１０．０，和空位延伸罚分为０．１，和ＢＬＯＳＵＭ３０相似性矩阵。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：BE琼斯，WD格兰特，S希普希，S格兰特，H里斯，
申请(专利权)人：金克克国际有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]