抗微生物多肽制造技术

本发明专利技术涉及具有抗微生物活性的多肽及具有编码所述多肽的核苷酸序列的多核苷酸。本发明专利技术还涉及核酸构建体、载体及包含所述核酸构建体的宿主细胞以及产生和使用所述多肽的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】背景近年来，抗微生物剂的种类大量增加，然而抗性病原性微生物也平行增加。现在认识到抗性针对所有可临床用抗微生物剂。医学界对抗微生物抗性的反应是应用以前没有应用的针对抗性细菌的新的或备选抗生素。此方法需要持续研发新抗生素，作为可抑制或避开细菌抗性机制的现有化合物的修饰或作为化合物组合。本专利技术的目的是提供具有改善抗微生物活性的新多肽及编码所述多肽的多核苷酸。概述本专利技术第一方面涉及具有抗微生物活性的多肽，其包含如下氨基酸序列或其具有抗微生物活性的至少19个氨基酸的片段G-X1-X2-X3-R-X4-X5-X6-K-I-X7-X8-K-X9-X10-K-X11-X12-X13-X14-I-K-X15-X16-X17-X18-L-V-P；其中X1＝L或R； X2＝L、V、I或F；X3＝R或K；X4＝L、V、I或F； X5＝R、K、W或G；X6＝K、R、G、M、N或E；X7＝G、R、K或E； X8＝G、R、K或E；X9＝L或F；X10＝K或R； X11＝I、L、F、C或Y；X12＝G、A或T；X13＝Q、R、L或P；X14＝K、I、M、L或V；X15＝P、A、H、N或D；X16＝I或L； X17＝R、H、Q或P； X18＝I或K。本专利技术另一方面涉及具有抗微生物活性的多肽，其包含与以下氨基酸序列至多有两个氨基酸不同的氨基酸序列G-X1-X2-X3-R-X4-X5-X6-K-I-X7-X8-K-X9-X10-K-X11-X12-Z其中X1＝L或R； X2＝L、V、I或F；X3＝R或K；X4＝L、V、I或F；X5＝R、K、W或G；X6＝K、R、G、M、N或E；X7＝G、R、K或E；X8＝G、R、K或E；X9＝L或F；X10＝K或R； X11＝I、L、F、C或Y；X12＝G、A或T；Z＝R或X13-X14-I-K-X15-X16-X17-X18-L-V-P；其中X13＝Q、L或P；X14＝K、I、M、L或V；X15＝P、A、H、N或D；X16＝I或L； X17＝R、H、Q或P； X18＝I或K。本专利技术第二方面涉及具有编码本专利技术的多肽的核苷酸序列的多核苷酸。本专利技术第三方面涉及包含核苷酸序列的核酸构建体，所述核苷酸序列编码本专利技术的多肽，所述核苷酸序列有效连接指导在合适宿主中产生所述多肽的一种或多种控制序列有效连接。本专利技术第四方面涉及包含本专利技术的核酸构建体的重组表达载体。本专利技术第五方面涉及包含本专利技术的核酸构建体的重组宿主细胞。本专利技术第六方面涉及用于产生本专利技术的多肽的方法，该方法包含(a)在有益于产生所述多肽的条件下培养本专利技术的重组宿主细胞；和(b)回收所述多肽。本专利技术的其它方面将从以下描述及所附的权利要求书中是显然的。定义在进一步详细讨论本专利技术之前，首先对以下术语及惯用语进行定义抗微生物活性术语“抗微生物活性”文中定义为能杀死或抑制微生物细胞生长的活性。在本专利技术的上下文中，术语“抗微生物”欲表示杀细菌和/或制细菌作用和/或杀真菌和/或制真菌作用和/或杀病毒作用，其中术语“杀细菌”理解为能杀死细菌细胞。术语“制细菌”理解为能抑制细菌生长，即抑制生长的细菌细胞。术语“杀真菌”理解为能杀死真菌细胞。术语“制真菌”理解为能抑制真菌生长，即抑制生长的真菌细胞。术语“杀病毒”理解为能灭活病毒。术语“微生物细胞”表示细菌或真菌细胞(包括酵母)。在本专利技术上下文中，术语“抑制微生物细胞生长”欲表示细胞处于非生长状态，即它们不能增殖。对于本专利技术，抗微生物活性可根据Lehrer等人，Journal ofImmunological Methods，第137(2)卷，第167-174页(1991)中描述的方法确定。在具有抗微生物活性多肽的25％(w/w)的水溶液中，优选10％(w/w)的水溶液中；更优选5％(w/w)的水溶液中；甚至更优选1％(w/w)的水溶液中；最优选0.5％(w/w)的水溶液中；且特别是0.1％(w/w)的水溶液中于20℃孵育8小时后(优选4小时后，更优选2小时后，最优选1小时后，且特别是30分钟后，)，具有抗微生物活性多肽可能够将大肠杆菌(Escherichia coli)(DSM 1576)活细胞数降低至1/100。在微生物生长培养基中，加入1000ppm浓度时，优选加入500ppm浓度时，更优选加入250ppm浓度时，甚至更优选加入100ppm浓度时；最优选加入50ppm浓度时，特别是当加入25ppm浓度时，具有抗微生物活性多肽于25℃孵育24小时也能够抑制大肠杆菌(DSM 1576)的生长晕。在具有抗微生物活性多肽的25％(w/w)的水溶液中，优选10％(w/w)的水溶液中；更优选5％(w/w)的水溶液中；甚至更优选1％(w/w)的水溶液中；最优选0.5％(w/w)的水溶液中；且特别是0.1％(w/w)的水溶液中，于20℃孵育8小时后(优选4小时后，更优选2小时后，最优选1小时后，且特别是30分钟后，)，能够将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(ATCC 6633)的活细胞数降低至1/100。在微生物生长培养基中，加入1000ppm浓度时，优选加入500ppm浓度时，更优选加入250ppm浓度时，甚至更优选加入100ppm浓度时；最优选加入50ppm浓度时，且特别是当加入25ppm浓度时，具有抗微生物活性多肽于25℃孵育24小时也能够抑制枯草芽孢杆菌(ATCC 6633)的生长晕。本专利技术的多肽优选具有由SEQ ID NO1至SEQ ID NO57中任意一项1至29位氨基酸或SEQ ID NO58至SEQ ID NO69中任意一项1至19位氨基酸显示的氨基酸序列组成的多肽的至少20％抗微生物活性。在特别优选的实施方案中，所述多肽具有由SEQ ID NO1至SEQ ID NO57中任意一项1至29位氨基酸或SEQ ID NO58至SEQ ID NO69中任意一项1至19位氨基酸显示的氨基酸序列组成的多肽的抗微生物活性的至少40％，如至少50％，优选至少60％，如至少70％，更优选至少80％，如至少90％，最优选至少95％，如约或至少100％。片段文中应用时，氨基酸序列G-X1-X2-X3-R-X4-X5-X6-K-I-X7-X8-K-X9-X10-K-X11-X12-Z；其中X1＝L或R；X2＝L、V、I或F；X3＝R或K；X4＝L、V、I或F；X5＝R、K、W或G；X6＝K、R、G、M、N或E；X7＝G、R、K或E；X8＝G、R、K或E；X9＝L或F；X10＝K或R；X11＝I、L、F、C或Y；X12＝G、A或T；Z＝R或X13-X14-I-K-X15-X16-X17-X18-L-V-P；其中X13＝Q、L或P；X14＝K、I、M、L或V；X15＝P、A、H、N或D；X16＝I或L；X17＝R、H、Q或P；X18＝I或K；或SEQ ID NO1至SEQ ID NO57的任意一项或SEQ ID NO58至SEQ ID NO69的任意一项的“片段”为所述多肽的子序列，其中一个或多个氨基酸自氨基端和/或羧基端缺失。优选一个或多个氨基酸自羧基端缺失。片段可由至少19个氨基酸，如19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个氨基酸组成。优选片段自多肽的氨基端计数由至本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有抗微生物活性的多肽，其包含在ＳＥＱＩＤＮＯ：１中列出的氨基酸序列，或其具有抗微生物活性的至少１９个氨基酸的片段，所述ＳＥＱＩＤＮＯ：１为：Ｇ－Ｘ↓［１］－Ｘ↓［２］－Ｘ↓［３］－Ｒ－Ｘ↓［４］－Ｘ↓［５］－Ｘ↓［ ６］－Ｋ－Ｉ－Ｘ↓［７］－Ｘ↓［８］－Ｋ－Ｘ↓［９］－Ｘ↓［１０］－Ｋ－Ｘ↓［１１］－Ｘ↓［１２］－Ｘ↓［１３］－Ｘ↓［１４］－Ｉ－Ｋ－Ｘ↓［１５］－Ｘ↓［１６］－Ｘ↓［１７］－Ｘ↓［１８］－Ｌ－Ｖ－Ｐ；其中Ｘ↓［１］＝Ｌ或 Ｒ；Ｘ↓［２］＝Ｌ、Ｖ、Ｉ或Ｆ；Ｘ↓［３］＝Ｒ或Ｋ；Ｘ↓［４］＝Ｌ、Ｖ、Ｉ或Ｆ；Ｘ↓［５］＝Ｒ、Ｋ、Ｗ或Ｇ；Ｘ↓［６］＝Ｋ、Ｒ、Ｇ、Ｍ、Ｎ或Ｅ；Ｘ↓［７］＝Ｇ、Ｒ、Ｋ或Ｅ；Ｘ↓［８］＝Ｇ、Ｒ、Ｋ或Ｅ；Ｘ↓［９］＝Ｌ或Ｆ； Ｘ↓［１０］＝Ｋ或Ｒ；Ｘ↓［１１］＝Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｃ或Ｙ；Ｘ↓［１２］＝Ｇ、Ａ或Ｔ；Ｘ↓［１３］＝Ｑ、Ｒ、Ｌ或Ｐ；Ｘ↓［１４］＝Ｋ、Ｉ、Ｍ、Ｌ或Ｖ；Ｘ↓［１５］＝Ｐ、Ａ、Ｈ、Ｎ或Ｄ；Ｘ↓［１６］＝Ｉ或Ｌ；Ｘ↓［１７］＝Ｒ、 Ｈ、Ｑ或Ｐ；Ｘ↓［１８］＝Ｉ或Ｋ；并且其中组成所述多肽的氨基酸独立地选自Ｄ型或Ｌ型。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：DR塞古拉，PH米京德，HHK赫根豪格，A托西，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]