一种构建人TCRalphaCDR3区文库的方法技术

本发明专利技术涉及一种构建人TCR alpha CDR3区测序文库的方法，主要步骤包括：(1)提取人组织或全血总RNA。(2)逆转录RNA为cDNA，将接头序列连接到长链cDNA末端，通过通用C端引物和接头序列引物扩增包含CDR3区的TCR alpha。(3)通过Tn5转座酶打断TCR alpha并富集CDR3区序列。(4)通过illumina高通量测序平台进行测序。本方法适用于含有各类T细胞的组织，体液等样本的建库；采用5’RACE技术，可高效的无偏差的对人TCR alpha进行扩增，克服了多重PCR扩增所引起的模板拷贝数和扩增效率难以控制，产物发生偏移等问题；利用Tn5酶能将DNA打断和接头连接同步完成的功能和使用特异性的引物可对TCR alpha的高度可变区(CDR3区)进行快速准确的富集建库，使测序更有针对性，方便数据分析，节约测序成本。

A method of building a human TCRalphaCDR3 Library

【技术实现步骤摘要】
一种构建人TCRalphaCDR3区文库的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种高效无偏差构建人TCRalpha的CDR3区高通量测序文库的所需的引物和文库制备方法。
技术介绍
淋巴细胞通过其表面抗体识别特异性抗原来发挥免疫功能。其对抗原识别的特异性体现在克隆水平，即同一克隆的淋巴细胞能识别具有相同的抗原受体，识别同一抗原表位。T细胞抗原受体(TCR)是T细胞特异识别和结合抗原肽-MHC分子的结构，T细胞受体是异源二聚体，由两个不同的亚基所构成。95％的T细胞的受体由α亚基和β亚基构成，另外5％的受体由γ亚基和δ亚基构成，其比例会因为个体发育或疾病而变化。TRA是编码TCRalpha的基因座，其包含可变段(V)、连接段(J)和恒定区(C)3个基因，而V，J，C又分为若干等位基因，T细胞发育过程中TRA基因座内发生基因重组，为TCRalpha的多样性提供了分子基础，另外通过在基因重组位点附近的碱基的随机插入和缺失等机制，最终产生了多样性的TCR，以满足机体识别多种多样的抗原的需要。TCR的C区靠近细胞膜，连接跨膜区和胞内的末端，而V区负责识别多肽-MHC复合体。每个亚基的可变区本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种构建人TCR alpha CDR3区文库的方法，其特征在于：(1)提取人组织或全血总RNA；(2)以RNA为模板，SEQ ID NO.1为引物逆转录合成cDNA，在逆转录酶作用下将SEQ ID NO.4连接至cDNA的3’端；(3)采用半巢式PCR特异性扩增TCR alpha片段：使用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5进行第一轮PCR；使用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5进行第二轮PCR；其中SEQ ID NO.5作为通用引物，SEQ ID NO.3为在TCR alpha的C端序列，并带有测序接头；(4)使用磁珠纯化第二轮PCR产物；使用Tn5建库试剂盒进行DNA...

【技术特征摘要】
1.一种构建人TCRalphaCDR3区文库的方法，其特征在于：(1)提取人组织或全血总RNA；(2)以RNA为模板，SEQIDNO.1为引物逆转录合成cDNA，在逆转录酶作用下将SEQIDNO.4连接至cDNA的3’端；(3)采用半巢式PCR特异性扩增TCRalpha片段：使用SEQIDNO.2和SEQIDNO.5进行第一轮PCR；使用SEQIDNO.3和SEQIDNO.5进行第二轮PCR；其中SEQIDNO.5作为通用引物，SEQIDNO.3为在TCRalpha的C端序列，并带有测序接头；(4)使用磁珠纯化第二轮PCR产物；使用Tn5建库试剂盒进行DNA打断，使用SEQIDNO.6与SEQIDNO.7进行测序接头连接，建库；(5)文库用于illumina高通量测序平台测序。2.根据权利要求1所述一种构建人TCRalphaCDR3区文库的方法，其特征在于：步骤(1)所述样本为含有T细胞的新鲜或冰冻组织和全血样本。3.根据权利要求1所述一种构建人TCRalphaCDR3区文库的方法，其特征在于：步骤(2)所使用的逆转录酶为SmartScribeReverseTranscriptase,MaximaHMinusReverseTranscriptase、SuperscriptIIreversetranscriptase或SuperscriptIIIreversetranscriptase的一种；SEQIDNO.1为TCRalpha的C端特异性逆转录引物；SEQIDNO.4为一种用于高效快速扩增cDNA5’末端的锚定引物TSO，包括一段接头序列和5’末端的3个鸟嘌呤，其中前2个鸟嘌呤为单脱氧鸟嘌呤，第3个鸟嘌呤为锁核苷酸修饰鸟嘌呤，接头序列来源于illumina平台的序列片段，逆转录条件：42℃，9...

【专利技术属性】
技术研发人员：于海礼，吴海阳，袁江北，仇鑫，谭颖，
申请(专利权)人：重庆天科雅生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆,50