本发明专利技术建立的表达抗传染性法氏囊病病毒ｍｉＲＮＡ的重组禽腺联病毒制备方法属于基因工程和生物制品研究领域，包括ｓｉＲＮＡ的选择、双链短发夹寡核苷酸的合成与克隆、含ｍｉＲＮＡ表达盒禽腺联病毒转移载体的构建、重组禽腺联病毒的产生与鉴定、重组病毒表达的ｍｉＲＮＡ对传染性法氏囊病病毒复制和基因表达抑制作用的检测。与现有的其他技术相比，该系统不仅能在禽源细胞中有效、持久地表达ｍｉＲＮＡ，对传染性法氏囊病病毒复制和基因表达具有特异、持久的抑制作用，而且对家禽无任何致病作用，不仅可用于体外实验，而且可作为抗禽病毒感染的新型生物制剂进行开发。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程和生物制品研究领域。具体涉及一种表达抗传染性法氏囊病病毒微小RNA重组禽腺联病毒的制备方法。
技术介绍
RNA干扰(RNA interference, RNAi)是近年来快速发展的一种序列特异性 转录后基因沉默技术,在功能基因组研究、新药开发、癌症治疗和抗病毒感染 等方面具有广泛的应用。在抗病毒感染方面，现有的研究资料显示，RNAi 几乎能不同程度地抑制所有病毒(包括DNA和RNA病毒)的复制。具有RNAi作用的干扰RNA包括短干扰RNA (siRNA)和微小RNA (miRNA)。目前获得siRNA或miRNA的方法主要有化学合成法、体外转录 法和载体表达法。其中，人工合成的siRNA能获得满意的基因沉默效果，但 其合成成本昂贵且作用时间短暂；质粒载体表达siRNA或miRNA的时间相对 较长，表达载体易于大规模制备且费用较低，是目前最常用的方法，但表达 的siRNA或miRNA的抑制作用受细胞转染效率的限制。腺联病毒(AAV)是一类复制缺陷型DNA病毒，需在腺病毒等辅助病毒 存在下才能复制和增殖。作为基因转移载体，AAV具有无致病性、免疫原性 低、细胞感染谱广和外源基因表达稳定等优点，是很有应用前景的基因转移 载体。哺乳动物的AAV已被用做siRNA或miRNA的传递载体，表达时间及基 因沉默作用能维持数月之久，有的已进入人体临床试验。禽腺联病毒(AAAV) 具有与哺乳动物AAV类似的潜伏感染特性和基因组结构，已被证明能在禽源 细胞中稳定表达外源基因，但尚无用AAAV传递抗禽病毒siRNA或miRNA的 报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于建立能用于鸡体内外试验、通用表达抗禽病毒miRNA 重组AAAV的制备和使用方法。专利技术的技术方案包括siRNA的选择、短发夹双链寡核苷酸的合成与克隆、 含RNAi表达盒AAAV转移载体的构建、表达miRNA重组AAAV的制备以 及抑制病毒复制效果的检测a、 siRNA的选择用GenScrript Corporation (http:〃www.genscript.com) 的siRNA分析软件siRNA Target Finder分析鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV) 序列，获得针对不同毒株VP1或VP2基因保守区的候选siRNA;b、 短发夹寡核苷酸的合成与克隆根据禽源细胞RNAi专用载体pRFPRNAiC说明书，用通用引物和DNA多聚酶链式反应(PCR)合成短发 夹寡核苷酸，将PCR产物定向克隆入pRFPRNAiC载体；c、 含RNAi表达盒AAAV转移载体的构建用限制酶尸m/1和万smBI消 化含AAAV全基因组的pCR-AAAV载体，电泳分离后回收包括两端ITR的 4.1kb载体片段，用Klenow酶补平；用限制酶&/I和BamHI双酶切含RNAi 表达盒的pRFPRNAiC载体，电泳分离后回收RNAi表达盒，经Klenow酶补 平后与AAAV转移载体片段连接，获得含RNAi表达盒的重组AAAV转移载 体；d、 表达miRNA重组AAAV的制备将含RNAi表达盒的重组AAAV 转移载体、AAAV辅助载体pcDNA-ARC和腺病毒辅助载体pHelper组成三 质粒系统，用磷酸钙沉淀法转染AAV-293细胞，转染后72h收获细胞， -2(TC/37。C冻融4次后，用氯仿抽提和聚乙二醇沉淀重组病毒。在上述步骤d中，利用重组AAAV转移载体、AAAV辅助载体 pcDNA-ARC和腺病毒辅助载体pHelper共转染AAV-293细胞，产生的纯化 重组AAAV的感染性滴度大于5xl()S病毒颗粒/毫升。抑制病毒复制效果的检测以10病毒颗粒/细胞的剂量，用重组AAAV 转导鸡DF-1细胞系，转导后48h用IBDV感染，感染后24h用半定量RT-PCR、 50%组织细胞感染剂量(TCID5Q)测定法检测细胞培养中的IBDV滴度。利 用重组病毒转导鸡细胞，对IBDV基因表达的抑制效率大于90%，能使IBDV 的TCID5Q降低71g以上；在体外培养的细胞中，这种抑制作用至少维持96h， 具有严格的序列特异性；不仅可用于抗IBDV miRNA的表达，也可以用于抗 其它禽病毒miRNA的表达；不仅可用于体外试验，还可作为抗禽病毒感染 的新型生物制剂进行开发。本专利技术中，用GenScrript Corporation的siRNA Target Finder软件分析 IBDV序列，是因为该公司是提供RNAi产品和技术服务的专业公司，用其 软件预测siRNA的可靠性已被我们和其他人的实验证实；用pRFPRNAiC作 为miRNA的表达载体，是因为该载体专为禽源细胞RNAi试验设计，可同 时表达针对相同或不同病毒(基因)的两个miRNA，而目前常用的含人或鼠 HI或U6启动子的其它RNAi载体不能在禽源细胞有效表达siRNA或 miRNA;将mIRNA表达盒插在AAAV转移载体的ITR之间，构建的重组转 移载体可作为单独或同时表达不同miRNA的通用载体；用含miRNA表达盒 的AAAV转移载体、AAAV辅助载体pcDNA-ARC和腺病毒辅助载体pHelper 组成的三质粒系统转染法，可在禽源细胞中有效产生重组AAAV;产生的重 组AAAV能在禽源细胞中有效表达miRNA，表达的miRNA能特异、持久地 抑制IBDV复制和基因表达。与现有的其他技术相比，以AAAV作为miRNA传送载体不仅能在禽源 细胞中有效、持久地表达miRNA，而且对家禽无任何致病作用，不仅可用于 体外实验，而且可作为抗禽病毒感染的新型生物制剂进行开发。附图说明图1为miRNA表达重组载体的结构示意图。Amp代表氨卞青霉素抗性基因；PACTiN代表鸡肌动蛋白基因启动子；RFP代表红色 荧光蛋白基因；polyA代表转录终止信号；U6为鸡U6启动子；27ntU6 leader为U6前导 序歹ij; miRNA flank为miRNA30样侧翼序歹!j; pol III terminator为miRNA转录终止序歹U 。 图2为miRNA表达AAAV转移载体的结构示意图。pAITR-RFP-miRNA分另ij代表pAITR-RFP-miVPl 、 pAITR-RFP-miVP2E和 pAITR-RFP-miVP2con; Amp代表氨卞青霉素抗性基因；ITR代表AAAV末端反转重复序 列；RFP代表红色荧光蛋白基因表达盒；RNAi代表miVPl、 miVP2E和miVP2con表达 盒。图3为重组AAAV的电镜照片。图4为重组AAAV感染DF-1细胞的荧光显微镜照片。 图5为重组AAAV中miRNA表达盒的PCR检测结果。 M代表DNA分子量标准；1为pRFPRNAiC载体作为阴性对照；2为pRFPRNAiVP2E载体阳性对照；3 为 AAAV-RFP-miVP2E; 4 为 AAAV-RFP-miVPl; 5 为AAAV-RFP-miVP2con; 6为AAAV-RFP。图6为miRNA抑制IBDV基因表达的流式细胞术检测结果。 图7为miRNA抑制同源株IBDV复制的TCID5。检测结果。 图8为miRNA抑制同源株IBDV复制的RT-PCR检测结果。 图9本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种表达抗传染性法氏囊病病毒微小ＲＮＡ重组禽腺联病毒的制备方法如下： ａ、干扰ＲＮＡ的选择：用干扰ＲＮＡ分析软件ｓｉＲＮＡ Ｔａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ分析鸡传染性法氏囊病病毒ＩＢＤＶ序列，获得针对不同毒株ＶＰ１或ＶＰ２基因保守区的候选干扰ＲＮＡ； ｂ、短发夹双链寡核苷酸的合成与克隆：根据ＲＮＡ干扰载体ｐＲＦＰＲＮＡｉＣ说明书，用通用引物和ＰＣＲ合成短发夹寡核苷酸，将ＰＣＲ产物定向克隆入ｐＲＦＰＲＮＡｉＣ载体； ｃ、含干扰ＲＮＡ表达盒ＡＡＡＶ转移载体的构建：用限制酶ＰｍｌＩ和ＢｓｍＢＩ消化含禽腺联病毒全基因组的ｐＣＲ－ＡＡＡＶ载体，电泳分离后回收包括末端反转重复区的４．１ｋｂ载体片段，用Ｋｌｅｎｏｗ酶补平；用限制酶ＳａｌＩ和ＢａｍＨＩ双酶切含ＲＮＡｉ表达盒的ｐＲＦＰＲＮＡｉＣ载体，电泳分离后回收ＲＮＡｉ表达盒，经Ｋｌｅｎｏｗ酶补平后与ＡＡＡＶ转移载体片段连接，获得含ＲＮＡｉ表达盒的重组ＡＡＡＶ转移载体； ｄ、表达微小ＲＮＡ重组ＡＡＡＶ的制备：将含干扰ＲＮＡ表达盒的重组ＡＡＡＶ转移载体、ＡＡＡＶ辅助载体ｐｃＤＮＡ－ＡＲＣ和腺病毒辅助载体ｐＨｅｌｐｅｒ组成三质粒系统，用磷酸钙沉淀法转染ＡＡＶ－２９３细胞，转染后７２小时收获细胞，－２０℃／３７℃冻融４次后，用氯仿抽提和聚乙二醇沉淀重组病毒。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孙怀昌，王永娟，沈鹏鹏，张鑫宇，夏晓莉，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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