本发明专利技术提供了一种用作以肝脏（尤其是肝巨噬细胞）为靶的ＤＤＳ的药物载体的、含有糖链的白蛋白，其通过下述方式来提供：变异编码白蛋白的ＤＮＡ，使其成为编码包含可通过真核细胞进行糖链修饰的部分氨基酸序列，优选是编码含有Ｎ结合型糖链的共有序列的变异型白蛋白；在宿主真核细胞、优选是可以添加高甘露糖型糖链的宿主细胞中导入含有该变异ＤＮＡ的表达载体，从通过培养获得的转化体得到的培养物中回收含有糖链的白蛋白蛋白质。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种在特定的氨基酸残基上选择性添加了糖链的新型含職连的 白蛋白蛋白质，其制备方法及其用途。更具体地，本专利技术涉及包含可通过宿主 细胞进行^l连修饰的部分氨基酸的变异型白蛋白的该部分氨基酸上选择性地附加了糖链的、含糖链的白蛋白。编码该变异型白蛋白的DNA，通过培养含有 该DNA的真核细胞制备该含糖链的白蛋白蛋白质的方法，及该蛋白质作为药 物载体的用途。
技术介绍
人血清白蛋白(以下称为"HSA")广泛分布于体内血液及细胞间液中。 其一级结构是由585个氨基酸组成的，不具有 结构，且分子量大约为66.5kDa 的单纯蛋白质。该蛋白质在肝脏中的作用主要是负责维持血流中的正常渗透 压、及维持血液中的液体含量。因此，在多种临床状况下，例如外科手术、休 克、烧伤、浮肿引起的低蛋白血症等，存在血管液体损失的状态中，常用HSA 进行治疗。此外，HSA起到了作为多种血清分子载体的机能，由于安全性、生物适 应性、生物分解性、血中滞留性强，因此在动态特性方面存在问题的药物给药 系统(DDS)中可以作为伏选载体。目前存在舰HSA与药物不可逆结合的DDS，禾佣HSA的较长半衰期 来提高结合的药物在血中滞留性的方法、以及使用HSA修饰体作为主动输送 系统的载体的方法等。在前者中，已经尝试通过基因融合技术使半衰期较短的 蛋白质及生理活性肽等作为杂合体表达。另一方面，在后者中，尝试深入研究 了阴离子化、阳离子化等调节HSA的物理化学性质的方法，以及通过导入糖 结构、肽等存在于细胞表面的受体的识别元ft(装置)，实现精密的动态控制及 细胞特异鹏E定(非专利文献1至6)。在肝脏中己知存在识别糖残基及负电荷等的受体。利用这种性质，与琥珀 酸及半乳糖、甘露糖等结合的白蛋白可用于对肝脏靶向。然而，在对HSA进行化学1斷布时，了解至lj其具有(1) 劇隙合了非常多的糖残基，否则无法识别肝脏； 半孚L糖修饰的白蛋白除一瞎每个白蛋白分子上结合10个以上的半乳糖，否则无法识别肝脏(参见非专利文献5)。(2) 对肝脏非实质细胞群的细胞特异性劍氐 甘露糖及岩藻糖修饰的白蛋白已知可被肝内皮细胞及肝巨噬细胞两种细胞吸收(参见非专利文献6)。(3) !艮难制备均一的结合体，必须找到适当的结合^f牛； 等等的问题。因此，强烈希望开发出一种使用非化学手段修饰HSA的方法。非专利文献l: LeeYC等人，Biochemisty 15: 3956-3963， 1976 非专禾U文献2: Opanasopit P等人，Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol.280: 879-889， 2001非专利文献3: TakakuraY等人，Int. J. Pharm. 105: 19-29， 1994 非专利文献4: Yamasaki Y等人，J. Pharmacol. Exp. Ther. 301: 467477， 2002 非专禾!j文献5: Nishikawa M等人，Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol.268: G849-G856, 1995非专利文献6: HiguchiY等人，Int. J. Pharm. 287: 147-154， 2004 本专利技术的目的是提供一种可在肝脏、尤其是肝巨噬细胞中特异性移动的、均一的含糖链的白蛋白，更具体是提供血清白蛋白，还提供一种适用于递送至肝脏的DDS的药物载体。本专利技术人为了达成上述目的，进行锐意研究，得到以下结果禾U用定点诱变法，将N结合型Hf连的共有序列(Asn-X-Thr/Ser)导Ali码HSA的DNA 中，il31培养经含有编码所获得的变异型HSA的DNA的表达载,化的巴斯 德毕赤酵母(Pichiapastons)，成功制备了肝脏转移性较高的、在该共有序列的 Asn残基上添加添加了高甘露糖型糖链的含糖链的HSA，由此完成了本专利技术。
技术实现思路
艮P，本专利技术提供了(1) 包含可通过宿主细胞进fi^l修饰的部分氨基酸的变异型白蛋白 的该部分氨基酸Jl^择性地附加了糖链的、含m连的白蛋白；(2) ， (1)所述的蛋白质，其中糖链是高甘露糖型糖链；(3) 上述(1)或(2)所述的蛋白质，其中该部分氨基酸序列至少一个是Asn-Xaa-Thr或Asn-Xaa-Ser (Xaa是涉及遗传编码的任意 氨基酸)；(4) 上述(3)所述的蛋白质，该部分氨基酸序列全部是Asn-Xaa-Thr 或Asn-Xaa-Ser (Xaa是涉^it传编码的任EM基酸)；(5) 上述(1) - (4)任一项所述的蛋白质，该白蛋白是人血清白蛋白。(6) 上述(5)所述的蛋白质，具有与序列号2所示的氨基酸序列中 序号1-585所示的氨基酸序列同一的或基本上同一的氨基酸序 歹lj，氨基 号63所示的氮基酸是Asn和/或氨基,号320所 示的氨基酸是Thr或Ser禾口/或氮基lW号494所示的氨基酸是 Asn;(7) 上述(6)所述的蛋白质，至少氨基酸序号494所示的氨基酸是 Asn;(8) —种编码变异型白蛋白的DNA，其中所述的变异型白蛋白含有 ffl31真核细胞进fi^ll连修饰的1个以上的部分氨基SW列；(9) 一种表达载体，其含有位于宿主真核细胞的功能性启动子的控制 下的上述(8)所述的DNA;(10) —种转化体，其通过在宿主真核细胞中导入上述(9)所述的表 达载体而获得；(11) 上述(10)所述的转化体，其中所述宿主真核细胞是酵母；(12) ， (11)所述的转化体，其中所述酵母是毕赤(f * 7 )属酵 母；(13) 上述(1)所述的蛋白质的制备方法，包括在培养基中培养上述(10) - (12)任一项所述的转化体，从得到的培养物回收含有 的白蛋白；(14) 药物，其含有如上述(1) - (7)任一项所述的蛋白质；(15) 药物载体，其含有如上述(1) - (7)任一项所述的蛋白质的递 皿至肝脏；(16) 上述(15)所述的载体，其中耙细胞是肝巨噬细胞；以及(17) 药物组合物，其含有能递送至肝脏的医药化合物及上述(15)或(16)所述的载体。本专利技术的含有糖链的白蛋白可被肝脏、尤其是肝脏的非实质细胞，更具体 的是肝巨噬细胞中特异性吸收，因此可用作针对该种细胞的药物载体。例如， 可以预见，如果针对肝虚血再灌流障碍的疾病给药在本专利技术的含有糖f连的白蛋 白上结合了抗氧化剂及氧化氮等的产品将具有良好的治疗效果。此外，由于肝 脏即使对一条糖链也有强烈的识别作用，因此可以在不对白蛋白本身的结构、 机能产生影响的情况下使用。并且，由于是来自基因重组的蛋白质，因此无需 担心混入未知病毒等来自血液的制齐啲特有问题，故可安全地施用于人体等。附图说明图1示出根据试验例1的、本专利技术的含有糖链的人血清白蛋白递送至血浆 (上)及肝脏(下)的移动性时效变化图。纵轴表示相对于给药量的比例(％)， 横轴表示给药后的时间(分)。图2示出在给小鼠的静脉内施用的、mIn标记的琥珀酸修饰(Suo)的牛 血清白蛋白(BSA)向血衆(上)、肝脏(中)及肾脏(下)的移动性图(参 见非专利文献3)。 Suc。-BSA中的n表示在BSA上结合的琥珀酸的数目。參表 示0.1mg本文档来自技高网...
【技术保护点】
含糖链的白蛋白，其是包含可通过宿主细胞进行糖链修饰的部分氨基酸的变异型白蛋白的该部分氨基酸上选择性地附加了糖链的、含糖链的白蛋白。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：中城圭介，片山直久，甲斐俊哉，小田切优树，
申请(专利权)人：尼普洛株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]
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