一种光敏雄性不育水稻的生产方法技术

本发明专利技术属于遗传工程和水稻培育领域，具体涉及一种光敏雄性不育水稻的生产方法。本发明专利技术创造性地将基因反向插入水稻表达载体，通过将该重组表达载体导入水稻愈伤组织细胞；诱导分化培养出一种光敏雄性不育水稻。本发明专利技术建立了一个可以随机配组生产杂交水稻的系统，取代目前虽然在生产上应用但存在许多问题的自然突变光温敏两用系。本发明专利技术的生产方法在培育杂交水稻方面，创建了一种可以随机配组的制种技术，扩大优良杂交稻组合的范围。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于遗传工程和水稻培育领域，具体涉及一种光敏雄性不育水稻的 生产方法。
技术介绍
我国的杂交水稻推广面积巳达2.2亿亩，约占水稻总面积的50%，产量占 到水稻总产量的60%。杂交稻每年增产的稻谷可养活大约7500万人口，为国民 经济的发展做出了巨大的贡献。杂交稻推广已有35年，目前面临进一步发展的难题。杂交稻的进一步发展 有两个方向l)发展一种可以随机配组的制种技术，扩大优良杂交稻组合的范围; 2)利用水稻亚种间强大的杂种优势挖掘杂交稻的增产潜力。目前在这两个发展方 向上存在两个瓶颈因为三系杂交稻不育系和恢复系的选育受到基因型的制约， 无法随机配组；水稻亚种间杂交存在不育性的障碍，很难在实践中加以利用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供。本专利技术提供了。该方法包括如下步骤(1) 将水稻程序性死亡基因反向插入表达载体的多克隆位点处；(2) 培养导入(1)所得的重组质粒的水稻愈伤组织细胞；(3) 诱导(2)所得的水稻愈伤组织细胞光照培养，分化出植株。 本专利技术的生产方法中，(l)所使用的表达载体可以是各种市售载体，例如，pCAMBIA1304、或者pBY520, pBin438等。本专利技术的生产方法中，(1)可以是将水稻程序性死亡基因反向插入pCAMBIA1304载体的35S启动子下游。本专利技术的生产方法中，(2)可以使用基因枪法或者脓杆菌法将重组质粒导 入水稻愈伤组织细胞。本专利技术的生产方法中，(2)中可以先将导入重组质粒的水稻愈伤组织细胞 进行恢复培养，然后利用潮霉素进行抗性筛选。本专利技术的生产方法中，(3)中可以将(2)所得水稻愈伤组织细胞置于分 化培养基上光照培养20-40天，分化出小植株后转移至生根壮苗培养基培养。水稻程序性死亡基因，即水稻C)^PZX:D基因，genbank登录号为AY327105 长约4.8kb， 全长cDNA由8个外显子组成。正常编码的cDNA长416 bp，编 码128个氨基酸。OsPDCD蛋白质氨基酸顺序如SEQ ID NO 2所示，其核苷酸 编码序列如SEQ ID NO 1所示。本专利技术采用水稻程序性死亡基因还包括如SEQ ID NO 1所示序列的简并序 列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO. l序列的编码框23-406位核苷酸中，有 一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于 密码子的简并性，所以与SEQ ID NO. 1中23-406位核苷酸序列同源性低至约 70%的简并序列也能编码出SEQ ID NO. 2所述的序列。该术语还包括与SEQ ID NO. 3中从核苷酸39-956位的核苷酸序列的同源性至少70%的核苷酸序列。大多数基因工程都是将基因的核苷酸编码序列正向插入载体，而本专利技术是 将OWDCD反向插入载体。本专利技术实施例1中实用的O^PDCZ)反向序列如SEQ ID NO 3所示。C^PDCZ)的主要转录产物为8个外显子组成的mRNA序列，全 长418bp。 一般反义基因工程中基因编码顺序的反义顺序都选择在mRNA的5' 序列，干扰效率较高。而本专利技术选取了 C^PDCD的全长mRNA的反义序列，以 期达到最大的干扰效果。本专利技术的生产方法中，未特别指出的步骤均可以采用常规技术。例如，将 重组质粒导入愈伤组织的方法、对愈伤组织细胞进行抗性筛选、愈伤组织细胞分 化培养等。当然，采用本专利技术实施例中列举方法，效果更佳。例如1. 选用成熟的水稻种子胚用于愈伤组织诱导。2. 成熟种子胚诱导的愈伤组织在第一次继代培育7-10天后用于基因枪 转化处理。3. 愈伤组织在潮霉素筛选培育基上的选择培养分两次进行，第一次筛 选压为30 mg/L潮霉素，时间14-17天，暗培养；第二次筛选压为30 mg/L潮霉 素，时间14-17天50 mg/L潮霉素，时间8-12天，暗培养。4. 采用基因枪导入法，获得多拷贝转基因无性系以方便选择对再生的 光周期敏感不育株。本专利技术的生产方法获得的水稻是一种光敏雄性不育水稻。 雄性不育系是指一种雄性退化(主要是花粉退化)但雌蕊正常的母水稻， 由于花粉无力生活，不能自花授粉结实，只有依靠外来花粉才能受精结实。因此， 借助这种母水稻作为遗传工具，通过人工辅助授粉的办法，就能大量生产杂交种子。光敏不育系既是不育系又是保持系。保持系是指一种正常的水稻品种，它的特殊功能是用它的花粉授给不育 系后，所产生后代，仍然是雄性不育的。因此，借助保持系，不育系就能一代一 代地繁殖下去。恢复系是指一种正常的水稻品种，它的特殊功能是用它的花粉授给不育系所产生的杂交种雄性恢复正常，能自交结实，如果该杂交种有优势的话，就可 用于生产。另一方面，本专利技术提供了一种含有水稻程序性死亡基因的重组载体，水稻 程序性死亡基因反向插入扩增载体或者表达载体的多克隆位点处。本专利技术的重组载体中，所述的表达载体可以是pCAMBIA1304、 pBY520， 或者pBin438，等等。本专利技术中，通常将基因插入载体的多克隆位点处。例如，在实施例1中， 将水稻OWDCD基因反向插入BsmFI禾口 BstEII酶切位点之间。本专利技术的生产方法获得的水稻可用于培育杂交水稻。本专利技术的生产方法获得 的水稻具有正常的表型，同时又是一种光敏雄性不育水稻，可以扩大优良杂交稻 组合的范围，解决了长期制约杂交水稻发展的瓶颈问题。实验证明，本专利技术的生产方法获得的光敏雄性不育水稻在长日照环境下可以恢复结实。用荧光定量PCR (real-time PCR)分析内源OsPDCD在对照中花11和anti-osPDCD转基因植株 中的表达量变化，包括①人工气候箱中，14.5光周期下，不同日均温度 情况；②人工气候箱中，日均温度25度下，不同光周期条件下③自然 长光照条件下。结果标明，在不同条件下，转基因不育株内源OsPDCD基因的 mRNA的表达量均低于对照。这进一步证实，水稻Oy尸DCD基因反向插入对本 专利技术的生产方法所得的水稻光敏不育特性起到关键作用。本专利技术的生产方法在培育杂交水稻方明有以下用途1 )利用水稻程序性死亡基因编码顺序或非编码顺序的反义序列构 建组成性或组织特异性表达载体转化水稻，培育光周期敏感雄性不育/可育两用 系；2) 利用水稻程序性死亡基因Os户DC"编码顺序或非编码顺序的反义序列构 建组成性或组织特异性表达载体转化水稻，培育光周期敏感雄性不育/可育两用 系用于配制生产杂交水稻；3) 利用水稻程序性死亡基因Os尸Z)CD编码顺序或非编码顺序的反义序列 构建组成性或组织特异性表达载体转化水稻，将培育的光周期敏感雄性不育/可 育两用系用作亲本，将该不育特性转移到其它水稻品种并用于杂交稻制种；4) 利用植物程序性死亡基因同源基因的反义序列构建组成性或组 织特异性表达载体转化经济作物或粮食作物，培育光周期敏感雄性不育/可育两 用系；5)利用植物程序性死亡基因Os户i)Ci)同源基因的反义序列构建组成性或组 织特异性表达载体转化经济作物或粮食作物，培育光周期敏感雄性不育/可育两用 系用于配制生产杂交种。本专利技术提供了。创造性地将基因反向插 入水稻表达载体，从而建立了一个可以随机配组生产杂交水稻的系统，取代目前 虽然在生产上应用但存在许多问题的自然突变光温敏两用系。本专利技术的生产方法 在培育杂交本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种光敏雄性不育水稻的生产方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：　（１）将水稻程序性死亡基因反向插入表达载体的多克隆位点处；　（２）培养导入（１）所得的重组质粒的水稻愈伤组织细胞；　（３）诱导（２）所得的水稻愈伤组织细胞光 照培养，分化出植株。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨金水，王玉锋，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]