本发明专利技术公开了一种草鱼肠道细胞胞质苹果酸脱氢酶的基因，以本实验室保存草鱼肠道ｃＤＮＡ文库中胞质苹果酸脱氢酶ＥＳＴ序列为模版设计引物，结合ＲＡＣＥ技术，用ＰＣＲ法扩增克隆得到草鱼肠道细胞胞质苹果酸脱氢酶基因的全表达序列。对于研究草鱼肠道细胞胞质苹果酸脱氢酶基因结构组成，探讨其在草鱼肠道代谢调控中的作用和功能区域位置，以及与其他物种的区别都提供了重要的理论依据。本发明专利技术对探索建立草鱼基因组计划与功能饲料产业化之间纽带的方法具有开创性作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学中的基因克隆领域，尤其涉及草鱼胞质苹果酸脱氢酶基因的核苷酸及氨基酸序列。
技术介绍
苹果酸脱氢酶(MDH)广泛分布于生物体内，是一种活性非常强的酶，它催化草酰乙酸盐和苹果酸盐 的相互转化反应，与二核苷酸辅酶的氧化还原相关。草酰乙酸盐在许多代谢途径中都有重要作用，包括三 羧酸循环、乙醛酸旁路、氨基酸合成、糖原异生等，并维持氧化还原平衡，还能促进胞质和亚细胞器代谢 物的交换。依生物体的功能不同、组织差异、细胞内定位的不同其表达种类不同，MDH具有多种同工酶 形式。胞质苹果酸脱氢酶(cMDH)存在于细胞胞质内，担负着将NADH转入线粒体的重任，并且还对调 控三羧酸循环有作用，同时cMDH还是核酸通路(NACh)复合体的一个组成部分。但目前对cMDH的研 究相对较少，且主要的研究集中在植物上。硬骨鱼类通常会表达两种平行基因形式的胞质苹果酸脱氢酶 (cMDH-S和cMDH-L)，这与鸟类和哺乳动物类这些四足动物只表达一种是不同的，而cMDH-L与线粒 体苹果酸脱氢酶(mMDH)很相似。目前NCBI上只能査到较少种类鱼类的cMDH的全长cDNA，而在淡 水经济鲤科鱼类中克隆到苹果酸脱氢酶(MDH)尚属首次。目前胞质苹果酸脱氢酶在草鱼基因研究上还属空白。本基因的获得可以进一步研究该基因在草鱼细胞 中的组成及基因结构，并为研究该基因在草鱼生长中的作用提供更高层次的科学服务，为研究草鱼功能饲 料提供理论依据和新思路。
技术实现思路
本专利技术的目的是以本实验室保存草鱼肠道cDNA文库中胞质苹果酸脱氢酶EST序列为模版设计引物， 结合RACE技术，用PCR法扩增克隆得到草鱼肠道细胞胞质苹果酸脱氢酶基因的全表达序列。上述目地是通过以下技术方案来实现的取出新鲜草鱼肠道组织，采用TRIzol (Invitrogen Corporation) —步法提取总RNA,甲醛变性凝胶 电泳和DNA/RNA calculator (Qenequant)检测总RNA质量。本实验室保存草鱼肠道cDNA文库中筛选到胞质苹果酸脱氢酶(cMDH)EST序列，经测序比对后发现该 EST序列具有胞质苹果酸脱氢酶cDNA的完整3'端，欠缺cDNA序列的5'端。利用cDNA末端快速扩增技术 (Rapid Amplification of cDNA ends, RACE)对目的基因的5端进行扩增。根据己知EST序列设计外侧和内侧两个特异引物5端特异引物1: 5'-AGAGCTTCCTGGCCTTGATGAC-3 ，5端特异引物2: 5'-TGAGGAGTGATTTCCCCAGATAATC-3 ，通用引物 Long:5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3' Short: 5'—CTAATACGACTCACTATAGGGC-3' 接头引物5'—AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3' 5端核心引物5'"(T)25V N-3' (N = A， C， G or T; V = A, G or C)以接头引物和5端核心引物反转录合成的第一链cDNA为模版进行PCR反应，上游引物使用通用引物， 下游引物使用5端特异引物1。PCR结果琼脂糖凝胶电泳胶回收后用通用引物和5端特异引物2进行PCR验证。 将验证后的序列片段连接到pMD18-T质粒，转入f.Co/ZJM109菌株，经质粒酶切验证后用M13通用引物测 序。扩增得到片段大小为681bp。再根据5端扩增片段和已知EST序列拼接所得结果设计引物对胞质苹果酸脱氢酶基因的开放阅读框进 行扩增，引物分别为上游引物5 ，-CACATCTCAACCTGCACAATCAGAC-3 ， 下游引物5 ，-CAGAGGAGTAGACGCCCATAGACAC-3 ，以接头引物和5端核心引物反转录合成的第一链cDNA为模版进行PCR反应，使用上下游引物进行 PCR反应。PCR结果琼脂糖凝胶电泳胶回收后连接到pMD18-T质粒，转入五.Coft'JM109菌株，经质粒酶 切验证后用M13通用引物测序。扩增得到片段大小为861bp。利用vector NT对扩增所得开放阅读框序列和全cDNA序列进行比对，对全序列进行调整后获得了完 整的草鱼肠道细胞胞质苹果酸脱氢酶基因序列，既目的基因。草鱼肠道细胞胞质苹果酸脱氢酶基因序列的获得可以进一步研究该基因在草鱼细胞中的组成及基因 结构，并为研究该基因在草鱼生长中的作用提供更高层次的科学服务，为研究草鱼功能词料提供理论依据 和新思路。具体实施例方式下面通过以下具体实施方式对本专利技术作进一步阐述，但本专利技术的内容完全不局限于此。1. 总RNA的提取挑选实验材料——健康雌性草鱼，体长570mm，约1.5冬龄(18个月)，2.4kg。取出新鲜草鱼肠道组 织，液氮迅速冷冻后保存于-80'C冰箱备用。采用TRIzol (Invitrogen Corporation) —步法提取总RNA，甲 醛变性凝胶电泳和DNA/RNA calculator (Qenequant)检测总RNA质量。2. cDNA第一链的合成取草鱼肠道细胞总RNA5ug与反转录引物(5端核心引物和接头引物)各lul(12uM)混合，70'C加 热2分钟，立即放置冰上，然后加入5 x buffer, 10mM dNTP混合液，20mM DTT， M-MLV反转录酶，反应体 系为10UL。反应过程为42。C l小时30分钟，之后加入90ul TE buffer (PH 8. 0) ， 72°C加热7分钟。最 后得到100ul草鱼肠道细胞cDNA模板，放入-20'C保存备用。3. 引物设计依据和合成方法在本实验室保存草鱼肠道cDNA文库中筛选到含有胞质苹果酸脱氢酶EST序列的转化子，送交测序， 并将测序结果在GenBank中进行比对，比对结果显示该EST序列含有胞质苹果酸脱氢酶cDNA的完整3' 端，欠缺cDNA序列的5'端。以该EST序列为模版设计2个5端特异引物，其中引物1用于初步扩增胞质 苹果酸脱氢酶cDNA的5端序列，引物2用于对初步扩增序列进行验证。引物序列设计后送交Invitrogen Corporation进行合成。5端特异引物1: 5'-AGAGCTTCCTGGCCTTGATGAC-3'5端特异引物2: 5'-TGAGGAGTGATTTCCCCAGATAATC-3'4. 草鱼肠道细胞胞质苹果酸脱氢酶基因cDNA全序列的克隆以草鱼肠道胞质苹果酸脱氢酶EST序列为模版设计的5端特异引物1和通用引物扩增片段约为681bp。 4.1用第一链cDNA末端快速扩增技术进行初步PCR扩增以上述合成的第一链cDNA作为模板，根据已知EST序列设计特异性引物1，利用cDNA末端快速扩 增技术(RapidAmplifkationof cDNAends， RACE)对目的基因的5'末端进行扩增。在5'RACE中，利用末端转移酶和接头引物在cDNA的5'末端加上CCC后，以加尾后的cDNA作为 模板，利用5端特异性引物l和通ffl引物进行PCR扩增，片段反应体系如下第一链cDNA模板1.5 uL，10xPCR反应缓冲液5uL， 25mmol/L MgCl本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种草鱼草鱼肠道细胞胞质苹果酸脱氢酶基因，其特征在于具有以下ＲＮＡ核苷酸及相应的氨基酸序列： ｇｃｔｇａｇｔｇｇｃ ａｇａｇｃａｇｃａｃ ａｔｃｔｔｔｇｇｃｇ ｃａｃａｔｃｔｃａａ ｃｃｔｇｃａｃａａｔ ｃａｇａｃｔｔｇａａ ６０ ａｃ ａｔｇ ｇｃｃ ｇａａ ｃｃｇ ａｔｃ ｃｇｔ ｇｔｃ ｃｔｇ ｇｔｇ ａｃｔ ９２ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ １０ １ ５ １０ ｇｇｃ ｇｃａ ｇｃｃ ｇｇａ ｃａｇ ａｔｃ ｇｃｃ ｔａｔ ｔｃｔ ｃｔｇ １２２ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｌｅ ｕ ２０ １１ １５ ２０ ｃｔｃ ｔａｃ ａｇｃ ａｔｔ ｇｃｔ ａａａ ｇｇａ ｇａｔ ｇｔｇ ｔｔｃ １５２ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｐｈｅ ３０ ２１ ２５ ３０ ｇｇｃ ａａｇ ｇａｃ ｃａｇ ｃｃａ ａｔｃ ａｔｃ ｔｔｇ ｇｔｇ ｃｔｔ １８２ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ ４０ ３１ ３５ ４０ ｃｔｇ ｇａｃ ａｔｃ ａｃｔ ｃｃｃ ａｔｇ ｃｔｇ ｃｃｔ ｇｔｇ ｃｔｇ ２１２ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｍ ｅｔ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｅｕ ５０ ４１ ４５ ５０ ｇａｔ ｇｇｇ ｇｔｃ ｇｔｃ ａｔｇ ｇａａ ｃｔｇ ｃａｇ ｇａｔ ｔｇｔ ２４２ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｃｙｓ ６０ ５１ ５５ ６０ ｇｃｔ ｃｔｔ ｃｃｔ ｃｔｔ ｃｔｇ ａｇｇ ｇａｔ ｇｔｇ ａｔｔ ｃｃｔ ２７２ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｒ ｏ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｐｒｏ ７０ ６１ ６５ ７０ ａｃｔ ｇａｔ ａａｇ ｇｔｔ ｇａｇ ｇ...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：徐恒，朱文漓，辜文博，顾继锐，吴江，王娟，
申请(专利权)人：通威股份有限公司，四川大学，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]
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