本发明专利技术公开了属于受污染土壤与水的生物降解处理技术领域的一种多环芳烃厌氧降解菌群的富集与驯化筛选方法及应用。在污染的土壤中按质量比加入电子受体、硫化钠和多环芳烃混合物，密封静置６个月后在充满氮气的厌氧箱内按比例加入基础培养基、微量金属液和维生素ｃ溶液的混合液，进行土壤驯化，在充满氮气的厌氧箱内向厌氧瓶内加入多环芳烃、基础培养基、微量金属液、维生素ｃ溶液及吸附剂，按水与土的质量比向厌氧瓶内接入富集驯化的土壤，并且按质量比加入电子受体与硫化钠。在温度为２０±２℃的旋转振荡器中培养２０～２５天后进行循环转接，循环５次以上即可得到厌氧降解多环芳烃的微生物菌群。本方法能够富集与驯化筛选到厌氧降解性能好的微生物菌群，对多环芳烃的降解速率范围为０．０１～１．０４ｍｇ.Ｌ↑［－１］.ｄ↑［－１］。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于受污染土壤与水的生物降解处理
，特别涉及一种多环芳烃厌氧降解 菌群的富集与驯化筛选方法及应用。
技术介绍
多环芳烃(PAH)是一类具有致癌、致畸、致突变作用的有机物，在环境中分布广泛且 具有生物难降解性因而引起人们的广泛关注。多环芳烃的好氧生物降解是最快的，并且已经 分离驯化出多株好氧降解菌。然而，、地下含水层或污染土壤通常是厌氧状态，使污染带中的 好氧微生物被厌氧微生物所替代，因此，多环芳烃的厌氧生物降解比好氧生物降解更加可行 且经济有效。由于缺少高效的多环芳烃的厌氧降解菌，制约了多环芳烃污染土壤及地下水厌 氧生物修复技术的进一步发展和应用研究。因此，筛选出多环芳烃高效厌氧降解菌对于治理 和修复多环芳烃污染土壤及地下水有重要的意义。到目前为止，国内还没有关于富集与驯化筛选多环芳烃厌氧降解菌群方面的文献报道。 李小明，陈坚，伦世仪在文献中报道的"降解对苯二甲酸厌氧微生物群快速驯化与富集技术"， 是与本申请最为相关的技术，但是由于多环芳烃特别是高于四环的稠环芳烃更难于被厌氧生 物降解，同时由于多环芳烃的水溶解性很低且对微生物有较高的毒性作用，使得对苯二甲酸 厌氧微生物群的驯化与富集技术无法适用于多环芳烃的厌氧降解微生物群的驯化筛选。同时， 驯化的环境条件，驯化周期，及驯化的过程参数选定等都对驯化效果有密切的关系，这些都 需要经过一系列的试验研究后才能确定出最佳范围。
技术实现思路
本专利技术的目的提供一种多环芳烃厌氧降解菌群的富集与驯化筛选方法及应用。其具体步 骤如下(1) 选用受石油污染的土壤，按土与水的质量比为1 1.2:1的比例加入去离子水，按土 与硫化钠的质量比为200 300:1的比例加入硫化钠，按土与多环芳烃的质量比为5000 6000:1的比例加入多环芳烃晶体混合物，按土与电子受体的质量比为150 200:1的比例加入 电子受体，混合均匀后密封静置时间大于6个月。(2) 向体积为100 200mL的厌氧瓶中加入7.5-8.0mL浓度为lg/L的萘、菲、芴和芘 的丙酮溶液，其中萘、菲、芴和芘的比例为150:10:1:1，为除去丙酮将厌氧瓶开口放置2天。(3) 按水与高分子树脂吸附剂的质量比为5:1的比例用去离子水将吸附剂清洗5次，然 后按乙醇与吸附剂的质量比为3:1的比例用99%的乙醇将吸附剂清洗3次，为彻底除去吸附 剂中的乙醇将清洗后的吸附剂在温度为60。C的烘箱中放置2天。(4) 在充满氮气的厌氧箱内向歩骤(2)中的厌氧瓶中入50-60 mL基础培养基、0.5mL 微量金属液和O.l mL维生素c溶液，为指示厌氧瓶内的厌氧状态加入O.l mL刃天青溶液； 其中基础培养基的组成为NH4C1:1.2 g丄-1， KH2P04: 1.2 g'L1， MgCl2: 0.15 g丄-1， CaCl2'2H20: 0.05 g'L";微量金属液的组成为CoCl2'6H20: 35 mg'i;1， CuCl2: 0.20 mg'i;1， H3B03: 6.0 mg丄1， MnCl2-4H20: 25 mg.L1， Na2Mo04.2H20: 3.0 mg.L 、 NiCl2. 2H20: 2.0 mg.L1， ZnCl2: 2.5 mg'L-1。(5) 在充满氮气的厌氧箱内向步骤(4)中的厌氧瓶内按水与吸附剂的质量比为160 170:1的比例加入步骤(3)处理后的吸附剂，按水与电子受体的质量比为200 300:1的比例 加入电子受体，按水与硫化钠质量比为1500 2000:1的比例加入硫化钠。将密封后的厌氧瓶 放置转速为100r/min的振荡器中5 7天。(6) 在充满氮气的厌氧箱内按水土质量比为200 250:1的比例向步骤(5)中的厌氧瓶 内接入步骤(1)驯化的土壤。将密封后厌氧瓶在温度为20±2°C、转速为lOOr/min的振荡器 中培养20~25天后。按接种体积比为200 250:1的比例转入另一按步骤(2)至(5)处理后的厌氧 瓶内，当转接次数大于5之后即可获得去除多环芳烃的厌氧降解菌群。所述电子受体为硝酸钠或硫酸钠，所述吸附剂为高分子树脂XAD-2或XAD-7。 本专利技术的有益效果是所述的方法能够富集与驯化筛选到对多环芳烃具有厌氧降解性能好的微生物菌群，对多环芳烃的最大降解速率范围为0.4 1.8mg丄—、d—1。具体实施例方式本专利技术提供一种多环芳烃厌氧降解菌群的富集与驯化筛选方法及应用。在污染的土壤中 按质量比加入水、硫化钠、硝酸钠、硫酸钠和多环芳烃混合物，密封后进行厌氧降解微生物 的富集与驯化。6个月后在充满氮气的厌氧箱内向加入多环芳烃、基础培养基、微量金属液、 维生素c溶液及吸附剂的厌氧瓶内接入富集驯化的土壤，并且按质量比加入电子受体及硫化 钠。在温度为20土2'C、转速为100r/min的振荡器中培养20 25天后，进行循环转接，在循环 次数大于5次后即可得到厌氧降解多环芳烃的微生物菌群。下面是以运用驯化的混合菌群进行了多环芳烃的厌氧降解试验，进一步说明本专利技术。实施例1运用本专利技术方法驯化的混合菌群在硝酸盐还原条件下进行了多环芳烃的厌氧降解试验， 结果表明纯菌种能够对萘、菲、芴和芘进行有效的厌氧降解；当萘的初始浓度为28.6mg/L时， 35天后能降解到0.05mg/L以下，当菲的初始浓度为1.02 mg/L时，25天后能降解到0.05mg/L以 下，当芴的初始浓度为0.11mg/L时，20天后能降解至lJ0.01mg/L以下，当芘的初始浓度为0.12 mg/L时，20天后能降解到0.01mg/L以下；萘、菲、芴和芘的厌氧降解速率分别为(菌体浓度为5xl()7个/mL) : 1.04mg.L工.cT"; 0.06 mg.L1《、0.01 mg.L".d"及0.01 mg.L1.(11。5实施例2运用本专利技术方法驯化的混合菌群在硫酸盐还原条件下进行了多环芳烃的厌氧降解试验， 结果表明纯菌种能够对萘、菲、芴和芘进行有效的厌氧降解；当萘的初始浓度为29.2mg/L时， 35天后能降解到0.05mg/L以下，当菲的初始浓度为0.97 mg/L时，25天后能降解到0.05mg/L以 下，当芴的初始浓度为0.09mg/L时，20天后能降解到0.01mg/L以下，当芘的初始浓度为O.ll mg/L时，20天后能降解到0.01mg/L以下；萘、菲、芴和芘的厌氧降解速率分别为(菌体浓度 为5xl()7个/mL)0.97mg.L十d、 0.05 mg丄".d"; 0.01 mg丄".d4及0.01 mg.L"'d1。权利要求1. 一种多环芳烃厌氧降解菌群的富集与驯化筛选技术，其特征在于，该技术的具体步骤如下(1)选用受石油污染的土壤，按土与水的质量比为1～1.2:1的比例加入去离子水，按土与硫化钠的质量比为200～300:1的比例加入硫化钠，按土与多环芳烃的质量比为5000～6000:1的比例加入多环芳烃晶体混合物，按土与电子受体的质量比为150～200:1的比例加入电子受体，混合均匀后密封静置时间大于6个月。(2)向体积为100～200mL的厌氧瓶中加入7.5～8.0mL浓度为1g/L的萘、菲、芴和芘的丙酮溶液，其中萘、菲、芴和芘的比例为150:10:1:1，为除去丙酮将厌本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种多环芳烃厌氧降解菌群的富集与驯化筛选技术，其特征在于，该技术的具体步骤如下： （１）选用受石油污染的土壤，按土与水的质量比为１～１．２∶１的比例加入去离子水，按土与硫化钠的质量比为２００～３００∶１的比例加入硫化钠，按土与多环芳烃 的质量比为５０００～６０００∶１的比例加入多环芳烃晶体混合物，按土与电子受体的质量比为１５０～２００∶１的比例加入电子受体，混合均匀后密封静置时间大于６个月。 （２）向体积为１００～２００ｍＬ的厌氧瓶中加入７．５～８．０ｍＬ浓度为１ｇ ／Ｌ的萘、菲、芴和芘的丙酮溶液，其中萘、菲、芴和芘的比例为１５０∶１０∶１∶１，为除去丙酮将厌氧瓶开口放置２天。 （３）按水与高分子树脂吸附剂的质量比为５∶１的比例用去离子水将吸附剂清洗５次，然后按乙醇与吸附剂的质量比为３∶１的比例用 ９９％的乙醇将吸附剂清洗３次，为彻底除去吸附剂中的乙醇将清洗后的吸附剂在温度为６０℃的烘箱中放置２天。 （４）在充满氮气的厌氧箱内向步骤（２）中的厌氧瓶中入５０～６０ｍＬ基础培养基、０．５ｍＬ微量金属液和０．１ｍＬ维生素ｃ溶液，为指示 厌氧瓶内的厌氧状态加入０．１ｍＬ刃天青溶液；其中基础培养基的组成为： ＮＨ↓［４］Ｃｌ：１．２ｇ.Ｌ↑［－１］，ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］：１．２ｇ.Ｌ↑［－１］，ＭｇＣｌ↓［２］：０．１５ｇ.Ｌ↑［－１］，ＣａＣｌ↓［２］.２Ｈ↓［２］Ｏ：０．０５ｇ.Ｌ↑［－１］；微量金属液的组成为：ＣｏＣｌ↓［２］.６Ｈ↓［２］Ｏ：３５ｍｇ.Ｌ↑［－１］，ＣｕＣｌ↓［２］：０．２０ｍｇ.Ｌ↑［－１］，Ｈ↓［３］ＢＯ↓［３］：６．０ｍｇ.Ｌ↑［－１］，ＭｎＣｌ↓［２］.４Ｈ↓［２］Ｏ：２５ｍｇ.Ｌ↑［－１］，Ｎａ↓［２］ＭｏＯ↓［４］.２Ｈ↓［２］Ｏ：３．０ｍｇ.Ｌ↑［－１］，ＮｉＣｌ↓［２］.２Ｈ↓［２］Ｏ：２．０ｍｇ.Ｌ↑［－１］，ＺｎＣｌ↓［２］：２．５ｍｇ.Ｌ↑［－１］。 （５）在充满氮气的厌氧箱内向步骤（４）中 的厌氧瓶内按水与吸附剂的质量比为１６０～１７０：１的比例加入步骤（３）处理后的吸附剂，按水与电子受体的质量比为２００～３００∶１的比例加入电子受体，按水与硫化钠质量比为１５００～２０００∶１的比例加入硫化钠。将密封后的厌氧瓶放置转速为１００ｒ／ｍｉｎ的振荡器中５～７天。 （６）在充满氮气的厌氧箱内按水土质量比为２００～２５０∶１的比例向步骤（５）中的厌氧瓶内接入步骤（１）驯化的土...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：豆俊峰，丁爱中，
申请(专利权)人：北京师范大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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