酰基载体蛋白－ＤＮＡ序列及合成制造技术

本发明专利技术提供了编码酰基载体蛋白的ＤＮＡ序列，该序列可用于生产作为终产物的酰基载体蛋白或在植物种子中提高种子油产量。还提供了被调节的启动子，其基本上可限定酰基载体蛋白在种子组织中的表达。（*该技术在2007年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本申请是1986年7月31日提交的美国专利申请891529号的后续部分。酰基载体蛋白是于蛋白质可被分离作体外使用，或者可使蛋白于细胞内被转移到叶绿体或与体内修变脂肪酸产生有关之细胞器内的条件下被转录的。本专利技术所提供的构建物可在种子组织中使用种子特异性启动子表达酰基载体蛋白。植物为食品原料和食物成品提供了丰富的来源。植物脂肪酸可广泛用于多种工业目的，如作为植物油用于烹调，用作润滑剂以及在醇酸树脂中用作特殊化学品等。大部分植物脂肪酸为18碳原子的，通常只有少数脂肪酸具有16个以下的碳原子。就许多应用目的来说，期望具有8至14个脂肪酸的脂肪酸。为此，在建立生产其中大部分脂肪酸为14或少于14碳原子之植物油的方法上集中了相当大的兴趣。为达到这一目的，必须改变导致脂肪酸生成並使之伸长为较高级脂肪酸之代谢途径的组成成分。为此，必须能够产生一种或多种脂肪酸代谢链上的成分，並借以改变植物代谢过程。此外，脂肪酸代谢途径中的个别成分还可能具有重要的工业应用价值。Kuo和Ohlrogge(Archives of Biochem.and Biophys.(1984)234290-296)描述了菠菜酰基载体蛋白的一级结构。Ohlrogge和Kuo(J.Biol.Chem.(1985)2608032-8037)报导了在不同组织中有不同表达的酰基载体蛋白的不同异构体。Crouch等人(J.Mol.Appl.Genet.(1983)2273-283)报导了编码napin蛋白之cDNA的合成。本专利技术提供了用于表达植物酰基载体蛋白的DNA构建物。特殊构建物是使用在种子成熟期间的植物胚胎中导致表达的转录起始区制成的。可通过改变参予脂肪酸生成之代谢途径的叶绿体或相关细胞器中的组成成分来调节脂肪酸的量和组成。本专利技术提供了生产酰基载体蛋白的方法及成分，其中酰基载体蛋白作为一种体外使用的或连同植物种子生成的终产物，可用以修变体内脂肪酸的表达。为此目的，须制备DNA构建物，其中是将编码植物酰基载体蛋白的序列连接到在预期宿主中有表达酰基载体蛋白之功能的转录起始和终止调节区上。该表达构建物在转录的5′-3′方向上提供了一个转录起始调节区(其为结构性的或调节性的)、一个编码酰基载体蛋白之至少一种功能性蛋白的开放读码，期望包括一个用于转位到叶绿体上作体内使用的转换肽序列，以及一个在适当的宿主中有功能活性的转录终止调节区。调节区将根据所用宿主而有所不同。当在原核或真核微生物，特别是单细胞宿主内表达时，可使用多种结构性的或可调节的启动子。在这些情况下，制备酰基载体蛋白的主要目的是将此酰基载体蛋白于体外使用。大多数情况下，构建物将包括在植物中有功能活性的调节区，用以提高酰基载体蛋白的产生，进而借以提高和/或修变脂肪酸组成。所用的编码序列可得自于天然来源，亦可以是合成的，或者以此两种途径得到的。为从天然来源获得基因，可使用多种植物或细菌作为基因的来源。这些植物包括菠菜、芸苔属植物如油菜或甘蓝型油菜、椰子、棉花、红花、向日葵、萼距花等。用以获得基因的各种方法包括制备基因组成cDNA文库。可基于酰基载体蛋白的氨基酸序列来制备探针。因为不同来源的酰基载体蛋白之间存在有相当程度的免疫交叉反应性，故可利用原核和真核生物的多克隆抗体自某特殊来源中分离酰基载体蛋白，並进一步用于自其它植物来源分离酰基载体蛋白。之后测定整个的或部分的酰基载体蛋白序列，並基于肽序列设计探针。如只测得部分DNA序列，该部分序列即可满足需要，或者移动基因以确保得到整个编码序列。一旦得到了预期的序列，即可以各种方法操纵之。当序列包括非编码的侧接区时，可使用核酸酶如Bal31切断侧翼区，亦可用限制性核酸内切酶作限制性酶切，或者使用体外诱变、引物修复来进行修饰，或者用其它方法向序列内引入突变或损伤。这样即在天然存在的序列上完成了转换、颠换、缺失和插入。此外，可以合成全部或部分序列，其中可改变一个或多个密码子以提供修变了的氨基酸序列，或者引入一个或多个密码子的突变以提供方便的限制性酶切点或达到其它与构建或表达有关的目的。可进一步使用合成的接合物或连接子，向基因内引入一个或多个方便的限制性酶切点。酰基载体蛋白可以是任何一种可见于某特殊宿主内的同工酶，如由Ohlrogge和Kuo定名的见于菠菜中的ACP-Ⅰ和ACP-Ⅱ(见上述文献)，或者见于其它植物宿主内的其类似物。其中特别有用的是菠菜酰基载体蛋白，尤其是具有下列序列的ACP-Ⅰ。菠菜 ACP-Ⅰ a)cDNA序列b)由DNA序列推测出的氨基酸序列c)经蛋白质序列分析(Kuo和Ohlrogge，1984，上述文献)测得的氨基酸序列＊b)和c)之间存在差异处该有用的序列通常有至少300bp，大多至少约360bp，较好是411bp，这里的整个编码序列包括411个碱基对。此外，可能还有自编码区之5′或3′末端伸展出的5′和3′非编码侧接区，长度可由1至200个或200个以上bp，通常有少于100bp，尤其是少于约10bp天然存在之非编码侧接区的起始密码子的侧翼。编码酰基载体蛋白或其功能性片段的开放读码在其5′端连接到转录起始调节区。有许多转录起始调节区均可利用，其提供了多种结构或调节功能，如包括结构基因的转录。根据所用宿主的不同，转录起始调节区可包括来自病毒、质粒之结构基因或染色体基因等的区域。前已述及的转录起始区有得自细菌和酵母宿主如大肠杆菌、枯草杆菌、啤酒酵母者，其包含有β-半乳糖苷酶基因、λ左或右启动子、糖酵解酶启动子等。用于植物的转录起始区是与nopaline、章鱼碱、mannopine、1，3-二磷酸核酮糖羧化酶(大和小亚基)、花椰菜镶嵌病毒的全长启动子、napin、云扁豆蛋白等的结构基因有关的区域。其中特别有用的是那些在种子生长期间受到调节的启动子，尤其是在胚胎的子叶中合成的启动子。这些调节区包括napin、云扁豆蛋白和大豆球蛋白等基因的调节区。特别有用的调节区是得自芸苔属，特别是油菜和甘蓝型油菜者。调节区一般至少约150bp且不超过约3500bp，大多不超过约2500bp，可望不多于约1000bp。虽然Crouch等人(上述文献)已描述了napin基因，但並没有公开其调节区，亦没有述及调节区在异源基因方面的应用。转录起始调节区和编码区可以直接连接，其中可存在有方便的限制性切点或者已向两个区域引入了这样的限制性切点，必要时亦可借助于合成的接合物或连接子。许多调节区是作为质粒得到的，其中起始和终止调节区被一多聚连接子所分离，这样即可得有许多适于结构基因插入的限制性切点。这些表达构建物大多是可为微生物宿主利用的。尽管已分离出了在植物中有功能活性的许多转录起始和终止区(特别是由Ti和Ri质粒上的基因中得到的)，但这些区域並没有达到包含多聚连接子、标志物、复制系统等的真正可用之构建物的水平。再者，对于本专利技术来说，其主要兴趣在于使表达得以调节，以便在种子中启动转录过程。为此目的，基因如napin基因是有重要意义的。可使用一筛选napin宿主(如Crouch，1983，上述文献中所述的油菜种子宿主)之基因组文库的探针来获得napin调节区，该探针包含一相邻于结构基因之3′或5′末端或中间编码序列的序列。通过鉴定于严格条件下与探针杂本文档来自技高网...

【技术保护点】
编码植物酰基载体蛋白的ｃＤＮＡ序列。

【技术特征摘要】
US 1987-7-28 078,924;US 1986-7-31 891,529的范围内可以实践某些改动或改进。权利要求1.编码植物酰基载体蛋白的cDNA序列。2.根据权利要求1的cDNA序列，其中所说的植物是菠菜。3.根据权利要求1的cDNA序列，其中所说的植物是芸苔属植物。4.根据权利要求3的cDNA序列，其中所说的芸苔属植物是油菜。5.根据权利要求3的cDNA序列，其中所说的芸苔属植物是甘蓝型油菜。6.包含编码植物酰基载体蛋白之开放读码的DNA构建物，所说的开放读码结合于在细胞宿主中有功能活性的转录和翻译起始及终止调节区並在其调节控制之下，其中至少有一种所说的调节区不同于所说开放读码的野生型区。7.根据权利要求6的DNA构建物，其中所说的开放读码编码菠菜或芸苔属植物酰基载体蛋白。8.根据权利要求6的DNA构建物，其中所说的调节区是在植物宿...

【专利技术属性】
技术研发人员：让C克里，维C克瑙夫，
申请(专利权)人：加利福尼亚基因公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]