通过器官发生和体细胞克隆变异使大豆属物种进行整株植物的再生制造技术

本发明专利技术提供了一种产生大豆属物种（最好是Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ），的器官发生组织培养物，并再生成整株植物的方法，该法涉及使用器官发生的组织培养基，而所说培养基中包括高浓度的细胞激动素（最好至少约为１０μＭＢＡＰ），而且最好还包括至少约为正常浓度３倍的ＭＳ微量营养物。器官发生培养基适用于产生具有由体细胞克隆变异而诱发的所需性状的植物。（*该技术在2007年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及从大豆和其他大豆属(Glycine或G.)物种的体外组织培养物再生成整株植物的器官发生方法，以及在所说物种中诱发体细胞克隆变异。探求从组织培养物中获得大豆及其亲属再生的方法历来已久。大豆与烟草和矮牵牛这类容易再生的物种不同，以往对于将其从组织培养物再生成整株植物的大量尝试均未成功。组织培养物是十分理想的，它可以使所需的性状经由体细胞克隆变异引入大豆或能以此结籽的物种(如G.Soja)内。它们对遗传工程师也将有所稗益，可使细胞经土壤杆菌感染或采用其他手段而使之在培养物中转化，由此产生含有外来DNA的转化细胞，然后该转化细胞被再生成能结籽和表达外来基因的整株植物。文献“D.A.Evans，et al(eds.)(1983)in Handbook of Plant Cell Culture，vol.l，at pp.178-179，”中讨论了通常用于植物体外繁殖体增殖的三种可能途径(a)增强腋芽释放;(b)通过器官发生而产生不定枝;和(3)体细胞胚的发生。从分生组织、嫩芽端或萌芽的培养物中进行腋芽再育而作为一种再生手段，它涉及使用业已在体内分化的初发枝。因此为得到整株植物，仅需使其伸长和进行根的分化。另一方面，体外器官发生和胚发生涉及发育变化通常形成愈伤组织，其后再组合形成小植株。这对大多数植物来说均不易达到。埃文斯等人(上述文献178页)讨论了以往对大豆所用的器官发生法的失败原因，指出“液芽再育的诱发似乎在许多情况下均可适用，例如香石竹和大豆，而器官发生法和胚发生法对此均告失败”。在178至179页中，他们继续陈述“虽然借助于器官发生和胚发生，小植株的增殖速率是惊人的，但经若干次传代培养后，它们的再生能力往往迅速降低，以至最终其形态适应能力完全丧失。另一方面，腋芽再育的初始增殖速率相当慢。然而，在最初的一些传代培养期间，增殖速率增加，并最终将在其后的传代培养循环期间达到稳定状态。”因此，这些作者推荐不同于器官发生和胚发生的腋芽再育法来用于大批生产。“M.S.Wright，et al.，(1986)in“Plant Regeneration by organogenesis in Glycine max”，Plant Cell Reports，5150-154”中描述了芽再育的方法。该法包括使Glycine max(L.)种子在含有无机盐(其浓度为推荐值的一半)和5μMBA(苄基腺嘌呤，也称作BAP，即苄氨基瞟呤，CAS注册号为1214-39-7)的MS培养基(Murashige，T.and Skoog，F.(1962)Physiol.Plant.15473)上进行发芽。从发芽的幼苗上切去子叶节，并除去不是节的组织。将上述节组织的切片在发芽培养基上进行培养，然后移入相同的培养基中，但该培养基中无机盐的浓度仅为推荐值的1/4，而BA浓度仍为5μM。接着将节切细并移入另外的培养基中，最后移入包含土壤的培养基中，以使整株植物成熟。这一方法可看作是分生组织繁殖法，未经过反分化细胞的阶段。上述文献指示，大豆子叶节的特定表面区能被诱发而成为分生组织和出枝，并且在培养期间自始至终存在BA可使前期再生组织的枝形态的发生得以维持。有关从组织培养物中再生含有G.max(大豆)和G.soja的大豆亚属Soja的方法，研究成功者廖廖无几，不过在诸如G.canescens和G.clandestina之类的野生型亲属中已取得很大成功。，”Biotechnology in Agriculture and Forestry Vol.2Crops I(Y.P.S.Bajaj，ed.)283-308，(Table 4)]中概述了近年来有关大豆属体外再生的工作，并在293页上引用了以下讨论的题为“分生组织培养”的参改文献。“K.K.Kartha，et al.(1981)“Plant Regenerat-ion from meristems of grain legumessoybean，cowpea，peanut，chickpea and bean，”Can.J.Bot 591671-1679”中描述了在含有1μM NAA和0.05-0.1μM BA的培养基上，从大豆枝顶端分生组织中进行植物的再生。再生得到整株植物。在较高的BA浓度下形成愈伤组织，但未获得整株植物的再生。“T.Kameya，et al.(1981)，“Plant Regeneration from Hypocotyl Sections of Glycine Species，”Plant Sci.Lett.21289-294”揭示了使用G.Canescens和G.tomentella幼苗的胚轴切片在加有不同浓度NAA和BA的MS培养基上进行培养，以再生成正常植物。在包括G.max和G.soja在内的8个试验物种中，仅观察到G.canescens的胚轴切片有较高的嫩芽再生频率，所用BA浓度为1-5mg/l(5-25μM)。“T.Y.Cheng，et al.(1980)，“Plant Regenerat-ion from Soybean Cotyledcnary Node Segments in Culture，”Plant Sci.Lett.1991-99报道了用幼苗的调整子叶节片刺激培养物中大豆复枝芽的生成。所用的培养基含有0.25μM植物生长素IBA(吲哚丁酸)和5-50μM BAP。该法并不涉及愈伤组织的生成，而是使用分离块。若BAP浓度大于10μM，则会抑制主枝和根的生长，以及抑制子叶节区枝芽的生成。上述文献并未明确报道是否能再生得到可独立地在土壤中生长的整株植物。“H.Saka，et al.(1980)，“Stimulation of Multiple Shoot Formation of Soybean Stem Nodes in Culture，”Plant Sci.Lett.19193-201”同样描述了用含有植物生长素IBA和5-50μM BAP的培养基，在G.max的茎节或顶端生成枝芽。文内还报道了愈伤组织的形成，它影响枝芽的生成。但上述文献既未报道在愈伤组织中出现新的分生组织，也未报道整株植物的再生。上述参考文献无一对能产生新分生组织中心的组织培养物可被维持的器官发生的再生方法进行描述。除了在希尔达布雷恩(Hildebrand)等人的综述性文章中所引用的上述参考文献外，下述参考文献对目前技术发展水平作了阐述。“J.M.Widholm，et al.(1983)，“Shoot Regener-ation from Glycine canescens Tissue Cultures，”Pl本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产生包括大豆属物种细胞的器官发生组织培养物的方法，该法包括在含有细胞激动素的培养基上培养所说大豆属物种的未成熟胚，而所说细胞激动素的浓度应足够高，以防止胚发芽，并促使器官发生芽的产生。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：厄沙B巴韦尔，杰克M惠特霍姆，
申请(专利权)人：卢布里绍尔遗传学公司内华达公司，伊利诺斯州立大学理事会，
类型：发明
国别省市：US[美国]