重组火鸡疱疹病毒及其衍生的活载体疫苗制造技术

本发明专利技术涉及一种Ｔｕｒｋｅｙｓ重组疱疹病毒（ＨＶＴ）该病毒含有掺入ＨＶＴ基因组一个插入区的异种基因。本发明专利技术还涉及一种包含表达异种抗原多肽并对合适的动物宿主的感染诱导适应免疫反应的这样一种重组ＨＶＴ的载体疫苗。（*该技术在2010年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及含有引进HVT染色体组插入区中的异种核酸序列的重组火鸡(Turkey)疱疹病毒(HVT)，包括由所述HVT染色体组插入区衍生的DNA序列侧接的异种基因的核酸序列。包含所述核酸序列的质粒。制备重组HVT的方法，由重组HVT感染的细胞培养物，含有重组HVT的疫苗，以及制备这种疫苗和含有针对重组HVT抗体的抗血清的方法。马瑞克(Marek′s)病(MD)是一种使小鸡致癌的淋巴增生无序疾病，它导致T细胞淋巴瘤和外周神经的脱髓鞘作用，是造成家禽业经济损失的一个主要原因。马瑞克病的病毒(MDV)已被鉴定为MD的病原。原型MD疫苗由火鸡疱疹病毒(HVT)，最初由火鸡疱疹病毒中分离的血清型3MD病毒组成。它的不致病性、不致癌性、在体内和试管内的良好复制性、作为无细胞和联合细胞制剂时的可用性，以及高防护效能均已证实HVT可作为对有效控制家禽的马瑞克病十分成功和广泛应用的可靠疫苗。现在，动物一般能够使用活的或失活的疫苗，或通过由相应病原体亚单位所衍生的疫苗来防止致病微生物的感染。但是，这些类型的疫苗可能会有许多缺点。使用稀释的活病毒疫苗总免不了要冒使用不适当稀释致病微生物来给动物接种的危险。此外。稀释的病毒可能回复成毒性状态，导致被接种的动物患病，并可能蔓延使其它动物致病。失活的疫苗通常只诱导低水平的免疫性，需要附加的免疫接种。进而，诱导病毒抗原因子的平衡可能通过失活处理而改变，结果降低了疫苗的防护效力。此外，联合活体病毒疫苗的问题是各抗体组分的相互影响，这导致一种或多种构成组分相效力降低。重组或自然衍生的亚单位疫苗还显示出许多缺点。首先，作为非复制构成物存在于免疫系统的多肽亚单位通常不诱导长期持久的免疫性，还需要存在佐剂。其次，作为复制构成物存在能比作为亚单位构成物存在时更有效地诱导免疫性。本专利技术的目的是提供一种重组HVT，它不仅能用于制备抗MD疫苗，而且还能用于制备抗其它家禽传染病的疫苗，它排除了作为疫苗与活的稀释病原体联合使用的任何潜在危险，它以有效的方式促进体液的和细胞的免疫系统而不必明显地需要佐剂，并且它提供了多价疫苗的可能性而不必冒各种抗原组分相互不利影响的风险。按照本专利技术，这种重组HVT的特征在于，它含有将多肽异种编码成HVT的异种核酸序列，所述核酸序列被引进HVT染色体组的插入区，所述区域如附图说明图1所示与由ORF-1的端部直至并包括ORF-5的染色体组区域相对应，而且位于HVT染色体组的DNA片断中，具有如图1所基本限定的限制性内切酶图。本专利技术的重组HVT可由任何HVT病毒株，例如PB-THV1(可由Intervet International购得)或病毒株FC126衍生而得到。在此使用的术语“重组HVT”指的是这样一种传染性病毒，它已经被掺入异种核酸序列，即对于与在HVT中自然存在的基因的核酸序列不同等的基因或其一部分编码DNA在遗传上改性。当细胞被重组HVT感染时，则重组HVT以异种多肽形式表达异种基因。术语“多肽”指的是具有生物活性的氨基酸分子链，不是指产物的特定长度，并且如果需要可在体内或试管内改性。例如通过糖基化、酰胺化、羧化或磷酸化;因此，特别是肽、寡肽和蛋白质均包括在多肽的定义之内。对于有效的重组HVT而言，其前提是将异种核酸序列插入在染色体组HVT序列的容许位置或区域，例如可被用于掺入异种序列而不破坏HVT的基本功能如感染或复制所需这些功能的位置和区域。这种区域被称为插入区。本专利技术所涉及的插入区对于掺入异种DNA而不破坏HVT基本功能而言以前尚未公开过。此外，还没有可得到的有关在此所述用于掺入异种DNA序列的HVT染色体组区域的限制性内切酶图的情报。为制备本专利技术重组HVT而被用于掺入异种DNA序列的插入区，位于经过用酶Sau3A部分消化染色体组HVT DNA而产生的17.5Kb限制性片断之中。所述片断经限制性内切酶制图详细分析(图1)，它基本上对应于HVT染色体组的Us区域，也许包括IRs和TRs结构的侧接部分。在HVT染色体组中的该Us区域和该IRs和TRs结构的相对位置由Igarashi等人示出(1987)。此处所述的插入区分别位于大约1.2Kb、3.5Kb和2.8Kb的三个邻接的XhoⅠ片断之中，并且开始于在HVT染色体组中1.2KbXhoⅠ片断左侧位置起始的开放读码(ORF-1)的末端(图1)。所述大约5Kb的插入区连续通过ORF′s2、3、4和5，包括位于其间的非编码序列。相应于上述插入区的DNA序列可被用于将基因插入HVT染色体组，而不会破坏病毒的基本功能。特别是，ORF-2和ORF-3可被用于异种基因的综合。对于在ORF-2和ORF-3中的异种基因，较佳的插入位点是图1所示的BglⅡ限制性位点。β-半乳糖苷酶基因被插入在ORF-2或ORF-3中的单一BglⅡ限制性位点，产生重组病毒，它是活的和稳定的，并且不仅在组织培养物中复制，而且还将鸡感染到如同由其中衍生出的HVT病毒一样可比较的程度。用特指的pMD07gal或pMD12gal质粒(图2)转化的大肠杆菌(E.Coli)被存放在C.N.C.M of the Institute Pasteur at Paris under accession number I-914和I-915，该质粒是通过将β-gal基因插入携带如图1所指出的相应XhoⅠ片断的pMD07和pMD12的单一BglⅡ位点而衍生出的。在另一个实施例中，ORF-4和ORF-5的显著部分已由HVT染色体组中缺失，并由β-半乳糖苷酶标记基因代替，导致重组病毒可与在ORF-2或ORF-3中含标记基因插入的重组HVT病毒比较。可以理解的是，对于HVT染色体组的DNA序列，在个别HVT病毒中间可能存在自然变化。这些变化可导致缺失、取代、插入、转化或增加一种或多种核苷酸，它们可能影响一个或多个限制性位点的位置，从而改变图1所示的限制性内切酶图。此外，为引起上述改变而使用基因工程技术存在着潜力，导致了具有与图1所示图相关的限制性内切酶图的DNA序列。很清楚，包括掺入位于HVT染色体组区域中的插入区内的异种基因，并以这样的相关限制性内切酶图为特征的重组HVT也包括在本专利技术的范围之中。此外，由于本专利技术标志出的插入区不表现出基本的功能，所以所述区域可部分或全部缺失，在此之后，异种基因可被掺入到所述缺失处。可以理解，包括掺入到与本专利技术插入区相应的HVT染色体组区域中的并以此为特征的异种基因也构成本专利技术的部分。总之，以上所基本限定的插入区表征了能被用于掺入异种核酸序列区域定位。本专利技术所提出的较佳目的是提供一种重组HVT，它包括被掺入到插入区的异种核酸序列，其主要特征是如SEQ ID NO1中所示的HVT DNA序列，它包括4个ORF。ORF-2，即一个209氨基酸的小开放读码位于核苷酸位置316和945之间，并包含来自pMD07用于将基因插入HVT染色体组(图1，SEQ ID NO1)的BglⅡ限制性位点，从而表明，对于通过ORF-2编码假设的多肽不具有将病毒保存在体内或试管内的基本功能。这也用于包含346氨基酸(SEQ ID NO3)的ORF-3，它在核苷酸位置1084和2124(互补的)之间以反向变换，并包含本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组ＨＶＴ，其特征在于该重组体含有一个异种核酸序列，所述核酸序列在ＨＶＴ基因组的插入区被引入，该区域相应于在具有基本上由图１所定义的限制性内切酶图的ＨＶＴ基因组的一个ＤＮＡ片段内部从ＯＲＦ－１末端直至并包括ＯＲＦ－５的基因组区域。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：帕乐斯杰克巴斯安东尼斯桑德美哲，约哈尼斯安东尼斯约瑟夫克拉森斯，阿尔伯特菲利普亚德兰墨齐特，
申请(专利权)人：阿克佐公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]