重组的百日咳毒素Ｂ寡聚体制造技术

可在抗百日咳疫苗中用作非反应原性组分的基因工程化改造的百日咳毒Ｂ寡聚体样多聚体蛋白质。该蛋白质是通过分别在异源宿主中表面亚基Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４和Ｓ５的各自顺反子成分、回收所得的亚基多肽，以及使之在体外结合以组装成多聚合成物而生产的。（*该技术在2012年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及百日咳毒素B寡聚体亚基的重组表达，以及亚基在体外结合以形成能够用于疫苗中的非反应原性多聚体组分，以引发抗博德特氏杆菌属引起感染的免疫保护性反应。对降低百日咳疫苗之不良反应的要求，促使人们研究以更好地了解病原体百日咳博德特氏杆菌的免疫原性成分。新的非细胞疫苗的一个重要成分是百日咳毒素(PT)，其为干扰哺乳动物细胞中激素信号转导的异六聚体ADP-核糖基转移酶(1-3)。存在于毒素S1亚基(4)中的这种酶催活性导致对百日咳疫苗接受者的毒性，且一般认为是引起不良反应的根源。因此，在生产毒素基百日咳疫苗中，主要关心的是除去S1亚基的酶促活性。目前，一般是用热或甲醛和戊二醛等类毒素剂处理疫苗材料，以达到使S1失活目的。这些物理失活方法的缺点是，严格地说，它们实质降低了毒素的保护性免疫原性;退一步说，则可在存放后出现分子的毒素相关性酶活性(5)。已发展了在大肠杆菌中以重组技术生产各百日咳毒素亚基(6)，以及鉴定S1亚基上与酶促活性有关的关键性区域和形成优势保护性抗原决定基(7)的方法。借助位点特异性诱变，可消除S1亚基的酶促活性，以损害S1亚基获得与形成保护性抗原决定基(8)或使该亚基与B寡聚体结合以组装或全毒素样多聚体(9)相适应的构象。据信B寡聚体具有细胞受体识别区域，其为S1亚基的传递平台(1.10-13);它可以作为没有S1亚基的，由亚基S2、S3、S4和S5，以分别为1∶1∶2∶1的近似比例组成的亚聚体大分子分离得到(1)。最近已证明，本来不具有与百日咳毒素毒性相关之ADP-核糖基转移酶活性的天然B寡聚体本身即足以诱发免疫保护反应(14-16);另外，在与美国食品与医药管理局DrusillaL.Burns博士和JuanL.Arciniega博士合作进行的重组蛋白质研究中，显示S1亚基似乎对B寡聚体的保护性反应没有明显贡献。因此，B寡聚体显然具有作为非细胞百日咳疫苗成分的可能。然而，在这些研究中所使用的天然B寡聚体是从全毒素分子中分离的，而且大多没有S1亚基(＞95%)，故以这种方式得到的B寡聚体具有可检测量的S1相关活性，而这一活性对其反应原性起到很大作用。附图说明图1显示本专利技术重组B寡聚体样多聚体(以下简称B寡聚体)的SDS-PAGE图谱。B寡聚体是按下文所述由重组体大肠杆菌产生的亚基S2、S3、S4和S5在体外组装而成，并在胎球蛋白-Sepharose柱上亲和层析纯化的(17)。用三氯乙酸(TCA)沉淀已用4M MgCl2从层析柱上洗脱的样品，并进行SDS-PAGE(19)。然后用考马斯蓝染色。泳道1)是天然PT(商品级);泳道2)是天然B寡聚体(商品级);泳道3)是重组B寡聚体。图2是图解显示B寡聚体制剂，包括本专利技术的重组B寡聚体制剂的促细胞分裂活性。在RPMI1640培养基中以两倍系列稀释所指出的B寡聚体制剂。然后在B寡聚体制剂中加入小鼠脾淋巴细胞，达到如横座标上标示的B寡聚体浓度。用常规方法检测胸苷掺入(19)。因为重组B寡聚体制剂储存在高浓度尿素(2M)中，而且因其初始蛋白浓度相当低，所以低稀释度的重组B寡聚体制剂中含有大量足可导致细胞死亡的残留尿素。各制备是天然B寡聚体(0);显示有最高浓度的含0.125M尿素的天然B寡聚体(b);以及含有0.125M尿素显示最高浓度的重组B寡聚体。图3说明用B寡聚体制剂免疫小鼠对PT之白细胞增多促进活性的影响。5只小鼠分别经腹腔内注射(i.p.)本专利技术的重组B寡聚体制剂(rB)或天然B寡聚体制剂(B)，加在总体积为0.5ml的含明矾佐剂的PBS-凝胶中，剂量分别为8μg(rBM/BH)1μg(rBM/BM)或0.1μg(rBL/BL)(见表1)。一组5只小鼠(标示“PT”)用PBS-凝胶作为对照免疫。一个月后，各组小鼠均用500ngPT(i.p.)攻击(但标示为“PBS＊”的组除外，该组用PBS攻击);4天后测白细胞计数。结果以白细胞计数的平均值加一个标准差表示。本专利技术提供了衍生于重组体材料之百日咳毒素的基因工程化改造的B寡聚体样多聚体蛋白质(重组B寡聚体)，以及其制备方法。简单地说，经基因操作(如位点特异性诱变)产生毒素之S2、S3、S4和S5亚基和这些亚基类似物的顺反子成分(“基因”)及其衍生物，并分别在不同转化的异源(“外来”)宿主中表达并收获之，然后于体外结合成类似天然B寡聚体的多聚体合成物，该合成物具有在白细胞中引发有丝分裂反应的能力，且更重要的是可诱导抗百日咳毒素的免疫保护反应。用本专利技术的重组B寡聚体或从百日咳博德特氏菌产生的PT中分离的天然B寡聚体免疫小鼠，产生在ELISA分析中显示可与PT反应并能中和PT对培养的中国仓鼠卵(CHO)细胞之细胞病理效应的抗体;由各制剂诱发的抗体滴度均相似。另外，用天然或重组B寡聚体免疫的小鼠可对抗PT的白细胞增多促进活性。这些数据证明，在体外由个别重组亚基组装的本专利技术的百日咳毒素B寡聚体是参予构成非细胞百日咳疫苗的适用候选成分。按以前所述的方法在重组大肠杆菌中生产各亚基(6)。在该重组体生产系统中，用起始蛋氨酸残基取代其固有信号肽序列以合成委员长亚基多肽;除亚基S4外，异源氨基末端蛋氨酸残基实质上均被内源性蛋氨酰氨基肽酶从各重组体蛋白质上切掉。因此S4亚基是一种“蛋氨酰成熟”多肽，也就是说，它是在其氨基末端携带蛋氨酸残基的天然成熟S4亚基的类似物。分别发酵以在各自的大肠杆菌重组体中合成各个重组体亚基蛋白质。从发酵液中回收细胞团，然后置于-60℃到-80℃下保存。于大约4℃，在1mM二硫苏糖醇(DTT)存在下，使细胞团两次通过压力为大约104psig的French榨压器，以破碎细胞。在这些发酵条件下，重组体亚基蛋白质是作为大肠杆菌中的不溶性包含体合成的。从细胞溶胞产物中回收这些包含体，并以差速离心法至少洗两次;第一次是在1%脱氧胆酸(DOC)和25mM Tris-HCl(pH7.9)中，第二次是在4M尿素和25mM Tris-HCl(pH7.5)中。将各种包含体制剂称重，并根据它们与亚基蛋白质的相对百分比例，即它们在天然B寡聚体中的近似摩尔比以化学计算量混合之(S2∶S3∶S4∶S5分别为1∶1∶2∶1)。加入在25mMTris-Hcl(pH8.5)中的6M盐酸鈲(GuHCl)和10mMDTT溶液，以溶解包含体混合物;然后在室温下将混合物轻轻搅拌过夜。离心(用JA20转子，以18，000rpm于2℃室温下离心30分钟)以除去不溶性材料。回收可溶性上清，并在GH25层析柱中用不含DTT的上述GuHCl-Tris缓冲液洗脱以除去过多的DTT。回收在或近似GH25柱之空体积处洗脱的蛋白峰部分。可在该步骤后的任何时间用6MGuHCl洗脱样品。加入Cu2SO4至终浓度为50μM;在室温和大气环境下将样品缓慢搅抖过夜。经此再氧化步骤后，使样品对含有2M尿素的100mM磷酸钾缓冲液(pH7.4)透析两次(每次用5升)。/透析包装管应有3，500道尔顿的截留分子量。透析期间形成一种不溶性沉淀物，其可经离心(JA14转子，13，000rpm，室温下离心20分钟)除去。收集上清于2-8℃下保存。然后将样品对磷酸盐缓冲盐水(PBS)于室温下透析过夜;透析液体积应不超过样品体积的10倍，并至少应换液一本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含亚基Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４和Ｓ５的百日咳毒素Ｂ寡聚体样多聚体蛋白质，其中Ｓ４是蛋氨酰成熟多肽，或该多聚体的类似物或衍生物。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：WN伯内特，VL马尔，
申请(专利权)人：安姆根有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]