西红柿斑点枯萎病毒制造技术

选自下列的分离的核苷酸序列： ＡＡＡＴＴＣＴＣＴＴ ＧＣＡＧＴＧＡＡＡＴ ＣＴＣＴＧＣＴＣＡＴ ＧＴＴＡＧＣＡＧＡＡ ＡＡＣＡＡＣＡＴＣＡ ５０ ＴＧＣＣＴＡＡＣＴＣ ＴＣＡＡＧＣＴＴＴＴ ＧＴＣＡＡＡＧＣＴＴ ＣＴＡＣＴＧＡＴＴＣ ＴＡＡＴＴＴＣＡＡＧ １００ ＣＴＧＡＧＣＣＴＣＴ ＧＧＣＴＡＡＧＧＧＴ ＴＣＣＡＡＡＧＧＴＴ ＴＴＧＡＡＧＣＡＧＡ ＴＴＴＣＣＡＴＴＣＡ １５０ ＧＡＡＡＴＴＧＴＴＣ ＡＡＧＧＴＴＧＣＡＧ ＧＡＧＡＴＧＡＡＡＣ ＡＡＡＴＡＡＡＡＣＡ ＴＴＴＴＡＴＴＴＡＴ ２００ ＣＴＡＴＴＧＣＣＴＧ ＣＡＴＴＣＣＡＡＡＧ ＣＡＴＡＡＣＡＧＴＧ ＴＴＧＡＧＡＣＡＧＣ ＴＴＴＡＡＡＣＡＴＴ ２５０ ＡＣＴＧＴＴＡＴＴＴ ＧＣＡＡＧＣＡＴＣＡ ＧＣＴＣＣＣＡＡＴＴ ＣＧＴＡＡＡＴＧＴＡ ＡＡＡＣＴＣＣＴＴＴ ３００ ＴＧＡＡＴＴＡＴＣＡ ＡＴＧＡＴＧＴＴＴＴ ＣＴＧＡＴＴＴＡＡＡ ＧＧＡＧＣＣＴＴＡＣ ＡＡＣＡＴＴＡＴＴＣ ３５０ ＡＴＧＡＴＣＣＴＴＣ ＡＴＡＴＣＣＣＣＡＡ ＡＧＧＡＴＴＧＴＴＣ ＡＴＧＣＴＣＴＧＣＴ ＴＧＡＡＡＣＴＣＡＣ ４００ ＡＣＡＴＣＴＴＴＴＧ ＣＡＣＡＡＧＴＴＣＴ ＴＴＧＣＡＡＣＡＡＣ ＴＴＧＣＡＡＧＡＡＧ ＡＴＧＴＧＡＴＣＡＴ ４５０ ＣＴＡＣＡＣＣＴＴＧ ＡＡＣＡＡＣＣＡＴＧ ＡＧＣＴＡＡＣＴＣＣ ＴＧＧＡＡＡＧＴＴＡ ＧＡＴＴＴＡＧＧＴＧ ５００ ＡＡＡＴＡＡＣＴＴＴ ＧＡＡＴＴＡＣＡＡＴ ＧＡＡＧＡＣＧＣＣＴ ＡＣＡＡＡＡＧＧＡＡ ＡＴＡＴＴＴＣＣＴＴ ５５０ ＴＣＡＡＡＡＡＣＡＣ ＴＴＧＡＡＴＧＴＣＴ ＴＣＣＡＴＣＴＡＡＣ ＡＴＡＣＡＡＡＣＴＡ ＴＧＴＣＴＴＡＴＴＴ ６００ ＡＧＡＣＡＧＣＡＴＣ ＣＡＡＡＴＣＣＣＴＴ ＣＣＴＧＧＡＡＧＡＴ ＡＧＡＣＴＴＴＧＣＣ ＡＧＧＧＧＡＧＡＡＡ ６５０ ＴＴＡＡＡＡＴＴＴＣ ＴＣＣＡＣＡＡＴＣＴ ＡＴＴＴＣＡＧＴＴＧ ＣＡＡＡＡＴＣＴＴＴ ＧＴＴＡＡＡＴＣＴＴ ７００ ＧＡＴＴＴＡＡＧＣＧ ＧＧＡＴＴＡＡＡＡＡ ＧＡＡＡＧＡＡＴＣＴ ＡＡＧＡＴＴＡＡＧＧ ＡＡＧＣＡＴＡＴＧＣ ７５０ ＴＴＣＡＧＧＡＴＣＡ ＡＡＡＴＧＡＴＣＴＴ ＧＣＴＧＴＧＴＣＣＡ ＧＣＴＴＴＴＴＣＴＡ ＡＴＴＡＴＧＴＴＡＴ ８００ ＧＴＴＴＡＴＴＴＴＣ ＴＴＴＣＴＴＴＡＣＴ ＴＡＴＡＡＴＴＡＴＴ ＴＴＴＣＴＧＴＴＴＧ ＴＣＡＴＴＴＣＴＴＴ ８５０ ＣＡＡＡＴＴＣＣＴＣ ＣＴＧＴＣＴＡＧＴＡ ＧＡＡＡＣＣＡＴＡＡ ＡＡＡＣＡＡＡＡＡＴ…。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
Tospovirus属内的病毒感染许多种植物品种，特别是烟草、花生、蔬菜和观赏植物。人们对Tospovirus属内的二种病毒，即西红柿斑点枯萎病毒(TSWV)和无耐性(impatiens)坏死斑点病毒(INSV)已经了解。西红柿斑点枯萎病毒(TSWV)是一种独特的植物病毒，其核酸-蛋白质复合体是由脂蛋白外壳所包裹，同时也是唯一的thrip传播病毒。这种病毒最近已被划分为布尼安病毒科中的Tospovirus属。TSWV病毒颗粒含有一个29K核蛋白壳蛋白(“NP”或“N”)，二个与膜相连的糖蛋白(58K和78K)和一个推测为病毒转录酶的200K大蛋白。该病毒基因组包含三个负链(-)RNAs，命名为L RNA(8900个核苷酸)、M RNA(5400个核苷酸)和S RNA(2900个核苷酸)，其中每个RNA由NP所包裹。通过对三个TSWV分离株所提取的S RNAs进行部分或全长序列分析，表明一个双义基因排列中存在二个开放阅读框(ORF)。较大的开放阅读框位于病毒RNA链上，能够编码一个52K非结构蛋白，而较小ORF位于病毒互补RNA链，通过一个亚基因组RNA翻译29K NP。双义编码策略也是TSWV M RNA的特征，在其开放阅读框内，编码58K和78K二个与膜相连的糖蛋白。TSWV L RNA已做测序分析，它能编码一个推测为病毒转录酶的200K大蛋白。以结构蛋白的血清学分析以及对细胞病变结构的形态学分析为基础，二个TSWV血清型，“L”和“I”已被鉴定并描述了特征。它们有血清学上保守的G1和G2糖蛋白，但是“I”血清型的NP在血清学明显不同于“L”血清型的NP。通过对“L”和“I”血清型的NP进行比较分析，表明在核苷酸和氨基酸水平上分别有62％和67％的一致性。TSWV具有广泛的寄主范围，感染50科中的360多种植物，并导致世界范围内蔬菜和观赏植物的重大经济损失。“L”血清型已广泛发现于大田作物，如蔬菜和杂草，而“I”血清型大多只局限于观赏作物。最近，一种葫芦分离株已被鉴定为一种独特的分离株，因为它能系统地感染西瓜和其它葫芦科植物。其NP与两种中任一种血清型的NP在血清学上是不相关的。尽管TSWV病害的传播有时可以通过选育抗性植物或通过使用非遗传学方法来减少，但是，要想通过传统方法来完全控制这种病毒总的来说已被证明是很困难的。自1986年以来，已有大量报道表明，利用病毒外壳蛋白(CP)基因所获得的转基因植物通常能抗该病毒的感染。这种现象常常被称之为外壳蛋白介导保护(CPMP)。保护水平从延缓病症表现至无病症和病毒累积。最近，二例报道分别表现能表达TSWV的核蛋白壳蛋白(NP)基因的转基因烟草植物能抗同源病毒分离株的感染。不过，由于TSWV具有许多生物多样性分离株，所以，测试转基因植物抗不同的TSWV分离株感染的效果是十分重要的。根据本专利技术，转基因植物表明能抗“L”血清型的二个异源分离株和“I”血清型的一个分离株，这标志着本专利技术的的研究结果在以前的报道的基础上有所拓展。我们的结果也表明，对“L”血清型的两个异源分离株的抗性，如果有的话，也主要发现于积累非常低水平NP的植物中，而积累高水平NP的转基因植物能抗“I”血清型的分离株。不过，尽管积累高水平N蛋白的植物确实表现出延缓病症表达，但是却没有观察到对一种Brazilian分离株的抗性。这种称为TSWV-B的Brazilian分离株具有在血清学上与“L”和“I”血清型明显不同的N蛋白，同时在生物学上又不同于一种葫芦分离株，也就是说TSWV-B不会系统感染甜瓜类或西葫芦。因此，本专利技术的一方面是通过克隆和测定其S RNA的序列以及与公开的其它TSWV分离株序列进行比较，来描述TSWV-B的特征。从以下对本专利技术的详细描述，包括下列实施例、附图和数据，本专利技术的各种目的将是显而易见的。在附图中附图说明图1描述了根据本专利技术从病毒RNA克隆NP基因的策略；图2描述了根据本专利技术西红柿斑点枯萎病毒的核蛋白壳蛋白(NP)基因在烟草原生质体中的体内瞬间表达；图3描述了根据本专利技术已测序的cDNA克隆在TSWV-B S RNA上的位置；图4描述了根据本专利技术表明TSWV分离株亲缘关系的枝形图(dendogram)；图5描述了本文描述过的TSWV分离株的血清学上的亲缘关系；图6描述了转基因植物中核蛋白壳蛋白(NP)积累水平与TSWV分离株的抗性水平的相关性；图7描述了根据本专利技术的一方面目的导入转基因植物中的TSWV-BL N编码序列；和图8描述了根据本专利技术的一方面目的，导入植物中的TSWV-BL半N基因片段。更具体地讲，图2描述了NP基因的瞬间表达，其中利用聚乙二醇(PEG)将构建体导入烟草子叶原生质体中。随后将转化的原生质体培养两天以表达NP基因。然后，从原生质体中提取蛋白质，并利用抗TSWV NP的抗体通过双抗多层酶联免疫吸附分析法(DAS-ELISA)测定NP。NP-和NP+分别代表用质粒pBI525-NP-和pBI525-NP+转化的原生质体。包裹抗体的浓度是5μg/ml，酶连接物稀释为1∶250。加底物后30、60和90分钟记录数据。在图3中，TSWV-B的一个S RNA图谱下边绘出了5个重叠cDNA克隆。用从被TSWV-B感染过的N.benthamiana植物中分离的双链RNA的随机引物合成这些克隆。在图4中，利用GCG序列分析软件包装中的聚类(pileup)程序比较序列。水平线与遗传距离成比例，而垂直线是任一长度，并不重要。更特别的是在图5中，N.benthamiana Domin被TSWV分离株感染。一感染的叶盘(0.05g)于12ml的酶连缓冲液中磨碎，然后利用TSWV-BL病毒粒子(BL病毒粒子)或TSWV-BL的NP(BL-NP)或TSWV-I(I-NP)的抗体，通过DAS-ELISA分析之。包裹抗体的浓度为1μg/ml；连接物的稀释对于BL病毒粒子为1∶2000，对于BL-NP为1∶250，而对于I-NP为1∶1000。这些结果是在加底物以后10分钟(BL)，50分钟(BL-NP)，或30分钟所记录的。关于图6，利用产生的抗TSWV-BL NP的抗体，通过DAS-ELISA分析了转基因植物的NP累积。加底物后150分钟标明植物，并将转基因植物划分成四类OD405nm不到0.050，OD405nm介于0.050和0.200之间，OD405nm介于0.200和0.400之间以及OD405nm大于0.400。对照NP(-)植物的OD405nm值从0至0.05。用Arkansas(Ark)和10W pakchoy(10W)分离株或Begonia的分离株浸染同种植物，然后于接种后约12天记录每种植物的敏感性。用Arkansas和10W pakchoy的分离株接种51个R1NP(+)植物，以及用Begonia分离株接种139个R1NP(+)植物，然后从中收集结果。线条以上数据代表被测试的R1NP(+)植物的总数。实施例ITSWV-BL RNAs的分离从Datura stramonium L.中按如下方法纯化TSWV-BL分离株在一个Waring搅拌器中，将感染组织用3体积的缓冲液(0.033MKH2PO4，0.067M K2HPO4，0.01M Na2SO4)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：D·贡萨维斯，SZ·彭，
申请(专利权)人：康乃尔研究基金会有限公司，
类型：发明
国别省市：