本发明专利技术涉及乳酸杆菌菌株及含有它们的药物组合物。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及乳酸杆菌菌株和含有它们的药物组合物。更具体地说，本专利技术涉及三种新的人源非嗜酸性乳酸杆菌菌株(鉴定编号为CNCM I-1390、CNCM I-1391和CNCM I-1392，1994年1月13日保藏于the CNCM Collection of theInstitut Pasteur)和一种新的人源嗜酸性乳酸杆菌(命名为CNCMI-1447，根据布达佩斯条约于1994年7月13日保藏于同一研究所)。乳酸细菌的治疗用途具有悠久和确定的历史，其可以追朔到本世纪的初期以及指明使用发酵乳对消费者健康状况的有利影响的各种研究(参考文献1-5)。自从那时起，乳酸细菌已广泛应用于制药工业，它们构成治疗病原菌引起的肠内疾病的各种制剂的活性成分并用作抗生素治疗中的辅药(参考文献6-9)。过去的几十年中，科学家们从整体上加深了对乳酸细菌的认识，特别是对乳酸杆菌的认识，获得了惊人的大量信息。不过，目前市场上的产品似乎并没有考虑到近期科研成果(参考文献10-11)。应该特别指出的是，许多研究已表明-乳酸杆菌在肠内微生物菌丛的调节中起到独特的作用，不仅产生乳酸还产生特殊的抗细菌物质(参考文献12-16)；-考虑到“宿主特异性”要求，这些细菌必须来自肠内环境，细菌再植入这种环境中(例如，为了应用于人类，这些细菌必须分离自人肠内系统，等等)以保证移生(参考文献17)；-乳酸杆菌与数种代谢活动有关，这些代谢活动与保持良好健康状态、防止多种病理状态特别相关；特别值得一提的是亚硝胺降解、细菌毒素中和以及防癌活性(参考文献18)；-粘附到肠上皮上的能力是肠内细菌的一个极为有利的特点(已经知道，多种病原菌在失去粘附粘膜的能力时就丧失其致病力)；因此，对乳酸杆菌而言，为了提供一种阻碍病原菌移生的屏障，其移生在上皮上的可能性也是特别重要的(参考文献10，19)-对分离自肠的菌株的分类已作过重大修正；这种生态系统中新细菌种的存在以及每种中特殊生物型的分化已被确认(参考文献20)；-在确定乳酸细菌菌株的可利用性中，这些菌株的“技术”性质(首先是对低温防腐处理的抵抗性)尤为重要；事实上，目前用于probiotic的目的乳酸杆菌菌株一般只对冻干条件稍有抗性(参考文献21)。冻干之后必须保持粘附性质(并不是总能达到的要求)。特别是，在试图分离出具有很高肠粘膜细胞粘附能力的乳酸杆菌的过程中，描述了“同源”分离方法，例如，从健康个体的粪便中分离。例如，US4839281、EP-A-199535和US5032399描述了分离自成人、特点为强粘附性质的嗜酸性乳酸杆菌菌株，粘附性质为与参考菌株相比，以粘附到人肠粘膜的一个细胞上的细菌细胞数量来量化。不过，对这一菌株的确切分类是有疑问的，在美国专利局对该申请进行实质审查时，作者自己声称，根据实验数据，所描述的乳酸杆菌属于非嗜酸性菌种(美国专利4839281，卷宗，答复1987年10月30的审查意见，第7页，最后一段)。Reniero等(参考文献27)报道了从两个婴儿的粪便中分离出干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei)的两个菌株。同样的菌株能在粪便中存在数日，这使作者把粘附性质归因于这些菌株。没有提到其它象上述那样的生物学或技术上的性质，而这些性质是本专利技术所要求的乳酸杆菌菌株的独特性质。实际上，发现菌株CNCM I-1390、CNCM I-1391、CNCMI-1392和CNCM I-1447(除了对肠内和颊细胞的粘附力之外，常优于参考菌株)，还具有下列特点-抑制人肠内病原菌生长的能力；-在各种条件(需氧和厌氧生活)、不同pH值下生长的能力；这些性质赋予了适应经过胃肠道过程中所要求的生理和病理条件的能力；-产生大量乳酸；-对胆汁抗性高；-对冻干的抗性，不会丧失粘附能力。这些菌株属于乳酸杆菌属且以一系列特点为特征，这使它们对数种病理状态的预防和治疗特别受人关注。本专利技术提供药物、兽药或营养组合物，其含有菌株CNCM I-1390、CNCM I-1391、CNCM I-1392和CNCM I-1447中的至少一种，优选为冻干形式，与适当载体混合。这些组合物可以口服施用或者与象乳、酸奶或乳制品这样的食品混合施用，以治疗或预防需要施用乳酸杆菌的胃肠道病理状态，例如，象肠道微生物异常(dismicrobism)、各种原因的腹泻、溃疡性结肠炎以及有关病理状态的情形。本专利技术的组合物也可以在抗生素治疗时施用，以保护非致病性肠道细菌菌丛。本专利技术的菌株的另一个重要特征是，它们是从健康新生儿和断奶后的婴儿的粪便中分离出来的。实际上人们已知，哺乳动物在出生时胃肠道是无菌的；但通常由母体的阴道和肛周菌丛迅速移生。有益微生物的这条自然迁移途径是剖腹产的婴儿所缺乏的；实际上，这种剖腹产的婴儿易于移生那些不那么有益的微生物。在早产儿中也观察到肠道由不那么有益的微生物所移生。在这两种情形中，通过口服施用本专利技术的菌株可以大大减少这种危险。另外，与母乳喂养的婴儿相比，瓶喂婴儿在其肠道中有数量更多的梭状芽孢杆菌、大肠杆菌和肠球菌。在这种情况下，用本专利技术的乳酸杆菌处理也有助于肠内菌丛的再平衡。所述各菌株可配制成只有本专利技术各菌株的混合物和/或与具有互补性质即不同内在特性的其它菌株一起形成的混合物。这种制剂的典型例子有含有至少一种具有高粘附性质的菌株与至少一种能产生大量L-乳酸的菌株的混合物。一种优选但绝非限制性的组合物可以这样制备将本专利技术的菌株CNCM I-1394和肠球菌Enterococcus faecium SF68以适当的量(例如，每种菌株为106～1010个细胞)与常用的添加剂或赋形剂混合。通常为胶囊、溶液或可饮用悬浮液、袋装粉剂和相似形式的每一单一剂量一般含有每一菌株约为106～1010细胞。还已经证明，本专利技术的乳酸杆菌在改善食品营养价值方面非常有用。特别优选的是得自乳或其衍生物的乳制品。下面介绍菌株的分离及其鉴定。实施例1菌株的分离和鉴定菌株分离自出生1～6天的新生儿。还从其它的断奶期婴儿取样。在诊所里，对受试者的粪便每天取样两次，并在厌氧条件下贮藏于无菌药签中。在LBSTM选择性培养基(Lactobacillus SelectionAgar，Oxoid)中进行乳酸杆菌的选择性初步分离。于37℃在厌氧条件下保温平板48小时(Gas Pack system，BBL)。在MRS液体培养基(de Man-Rogosa-Sharpe broth，Oxoid)中分离出所得菌落，进行第一系列再分离以获得纯培养物(在选择性琼脂培养基上涂片并分离单菌落之后)。这些步骤反映了Sharpe提出的方法(参考文献22)。对各菌株进行分离和纯化之后，对它们做进一步鉴定以便仅选择出那些属于乳酸杆菌属的菌株。接着检验下列特征形态学(用相差显微镜进行光学检测)、对革兰氏染色的反应(所有乳酸杆菌都是阳性的)、过氧化氢酶的存在(所有乳酸杆菌都是阴性的)、温育24小时后检测每种菌株的培养基中存在的两种乳酸立体异构体(用Boehringer kit进行酶法检测)。根据这些检测，可能把这些分离物归入乳酸杆菌属。接着，对各菌株进行冻干并于4℃贮藏。对所有这些鉴定为乳酸杆菌的菌株在碱提取后再进行质粒外形的分析(参考文献23)。这种分析可以鉴定分离本文档来自技高网...
【技术保护点】
乳酸杆菌属菌株，保藏于ｔｈｅ ＣＮＣＭ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ，编号为Ｉ－１３９０、Ｉ－１３９１、Ｉ－１３９２和Ｉ－１４４７。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：L莫哀里，V波塔茨，L戈慈尼，C德汉恩，
申请(专利权)人：伯拉考公司，
类型：发明
国别省市：IT[意大利]
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