生产大量存活的薄荷植株的体外组织培养方法技术

本发明专利技术涉及产生大量可存活薄荷植株的体外组织培养方法。本发明专利技术方法特别使用薄荷植株的特定茎部作为起始材料，并确定了产生大量植株的培养基和培养条件。这类植株可用于显微繁殖、突变体的选择、产生具有内源性次生代谢物水平改变的植株主用于基因工程。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生产出大量存活的薄荷植株的体外组织培养方法。本专利技术方法使用薄荷植株茎部的特定部分作为起始材料，并确定产生大量植株的培养基和条件。这类可用于显微繁殖、突变体的选择，用于内源性次生代谢物水平可变动的植株的生产和用于基因工程。各种种系的薄荷最早生长在印度、中国和日本，薄荷油、薄荷醇、维生素和其它代谢物对于药物工业极为重要。这些可用于芳香油和草药。本专利技术涉及用作从薄荷植株的特定部分生产大量植株的组织培养方法。本专利技术的方法为生产体细胞克隆和生理变体和通过农业生物技术的现代方法进行基因改进开创了新的可能性。薄荷由于它们有价值的次生代谢物，特别是薄荷油和薄荷醇，是全球性重要的作物，由于它是草本繁殖作物，已大量采用突变技术以改进其特征，如抗病性、产率、代谢物和油含量。但是可以采用组织培养技术通过对体细胞克隆变体的选择和基因工程来改良薄荷。本专利技术的一个主要目的是提供基于薄荷的显微繁殖进行大规模组织培养的简单方法。本专利技术的另一个目的是提供用于生理变体、体细胞克隆和突变体分离的有效工具和用于基因操纵薄荷的有效工具。已完整建立了通过组织培养技术对植株进行繁殖。各种植株种系已成功地通过器官形成或体细胞胚形成进行体外繁殖。器官发生导致形成器官，即发芽(或出根)，它们可分别诱导根(或芽)的形成以产生整个植株，而体细胞胚发生导致形成体细胞的胚芽(无需受精即形成胚芽)，它开始可同时发芽和出根，并能长成整个植株。虽然植株各个部分和细胞能繁殖成整个植株(称为全能性)是公知的现象，但每种植株或其植株部分需有特定的研究以得到满足这类繁殖的条件。现已测定了一些控制这类培养物生长和分化的广泛适用的因子。建立不同组植株激素和生长调节剂之间单独的相互作用或结合的相互作用是对存在于细胞、组织和器官中某些关系的反应。人们现已达成共识成功地引发分化取决于外植体的种类、外植体的生理条件和在培养时外植体的物理和化学环境。由于这个因素，组织培养学科涉及到优化植株源的生理条件、外植体的种类、培养条件和用来激发组织培养的植株激素。这表明开发通过组织培养使植株增殖的新方法是非显而易见的。本专利技术的一个主要方面逐个研究引发增殖的植株生长调节剂的种类和用量。此外，培养基的化学组合物、温度和其它培养条件在引发器官发生和体细胞胚发生、以及形成健康受精植株中都起着重要的作用。对培养基、激素和生长条件的反应各个植株种类不尽相同。因此，对于给定的植株，其植株有效繁殖的条件需要开创性的特殊知识。另一个主要领域是组织培养所需要的革新领域，它可识别足以对培养条件反应并得到繁殖的植株部分。不是所有给定植株部分都能有效地繁殖的。这是用作繁殖的植株部分(称为外植体)、外植体的生理状况和生长条件，特别是决定组织培养中植株成功的生长调节剂复杂的结合。来自给定植株不同外植体通常对增殖的生长条件有很不同的反应，没有通则可用于所得的增殖。在每种情况下，外植体的确定和培养条件的确定都是将植株部分增殖成大量植株的组织培养方法中的革新步骤。目前，已经报道通过增殖培养来繁殖许多种系的薄荷，但早期揭示的方法不是很有效。用于早期方法中的起始材料(外植体)是不同的。例如可使用腋生的嫩芽、叶片和胚胎作为起始材料。在这方面有几个报告已报道了薄荷的组织培养。其中一些也涉及建立细胞悬浮液培养物和愈伤组织。下面列出供参考。已经揭示了组织培养技术应用于植株有效成分的生产和生物合成，如从许多植株的切下的根培养物、愈伤组织和冠瘿组织中产生生物碱(West FR.Jr和Mike ES 1957“Synthesis of atropoine by isolated roots and root callus cultures ofballandona”Botan，Baz.11950-54；Klein RM 1960，“Plant tissue cultureaposssible source ofplant constituents”Econ.Botany 14286-289)。据报道，Menthapiperita和M.spicata的细胞混悬液和愈伤组织培养物能产生和生物合成次生代谢物(Lin和Staba 1961，“Peppermint and spearmint tissue cultures，callusformation and submerged culture”Leoydia 24139-145；Wang和Staba 1963“Peppermint an dspearmint Tissue culture IIDual-carboy culture of spearmintTissue”Jour.of Pharmaceutical science 521058-1062)。后来报道这类细胞悬浮液可将某些前体生物转化成单萜(Aviv D和Gulan E 1978“Biotransformation ofmonoterpene by Mentha cell linesconversion of pulegone to isomenthone”PlantaMedica 33；70-77；Aviv D，Krochmal E，Dantes A和Gulan E.1983，“Biotransformation of monoterpene by Metha cell linesconversion of pulegone-substituents and related unsaturated α-β ketones”Planta Medica 477-10)。据报道通过Mehtha arvensis的愈伤组织可产生三萜(Karasawa D和Shimzu S 1980，“Triterpene acids in callus tissue from Mentha arvensis var.”Piperascens.Mol.Agric.Biol Chem.441203-1205)。借助于GLC、TLC在培养物混悬液和愈伤组织培养物中也可发现少量薄荷醇(Bhaumik C和Dutta PC 1982，“Menthol in static andsuspension cultures of Mentha arvensis”Linvar piperascens HolmesIndian Durgs(July)387-388)。这些报道目的不在于从上述培养物中繁殖植株。已报道通过组织培养技术从Mentha spp的腋嫩芽复制抽芽(Rech EL和PiresMJP 1986“Tissue culture propagation of Mentha spp.by the use of axillarybuds”Plant Cell Reports 517-18，Revishankar GA和Venkatraman LV 1988“Rapidmultiplication of plants from cultured axillary buds of Mentha piperita”PhilippineJour.of Science 117121-129)。这些报道涉及从叶轴的预-存在的分生组织中抽芽的复制，可从M.vi本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过组织培养技术从薄荷植株的小组织（外植体）开始繁殖大量存活的和可生育的薄荷植株，所述的方法包括： （ｉ）切下薄荷植株的内结（外植体）， （ｉｉ）从内结片段（外植体）的表面除去诸如真菌、细菌、微生物等对该方法有潜在危害的污染物， （ｉｉｉ）在ｐＨ５．４－６．２范围里，在由下列物质构成的第一培养基中培养步骤（ｉｉ）所得的去污染物的内结部分： ａ．任何常规培养基的盐， ｂ．任何常规培养基的维生素， ｃ．碳源， ｄ．植株激素（植株生长调节剂）和 ｅ．凝胶剂 培养基通过压热器消毒，在冷白光存在下于２０－３５℃温度下培养， （ｉｖ）继续培养所述的内结片段，直到沿愈伤组织形成数个繁殖的芽， （ｖ）收获所形成的芽， （ｖｉ）在ｐＨ５．４－６．２的范围下，在由下列物质构成的能引发出根的第二培养基中培养所得的芽： ａ．任何常规培养基的盐， ｂ．任何常规培养基的维生素， ｃ．碳源， ｄ．植株激素（植株生长调节剂），和 ｅ．凝胶剂， 培养基通过压热器消毒，培养在冷白光存在下于２０－３５℃温度下进行至少２周，以形成根。...

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：苏希尔库马，希夫库马古普塔，萨维思立巴特，拉克什图里，
申请(专利权)人：科学工业研究委员会，
类型：发明
国别省市：IN[印度]