一种对野生型枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列进行了改良的枯草杆菌蛋白酶ＤＹ变异体，该野生型氨基酸序列包括第一环区、第二环区、第三环区、第四环区、第五环区和第六环区；其中改良的氨基酸序列是在一个或多个环区中一个或多个位置上有取代；其中： Ａ、当取代发生在第一环区时，在５８、５９、６０、６１、６２、６４或６５位的一个或多个位置上发生取代，其中 ｃ．取代发生在第６０位时，取代氨基酸为Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ或Ｓｅｒ； ｆ．取代发生在第６４位时，取代氨基酸为Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ或Ｓｅｒ；以及 ｇ．取代发生在第６５位时，取代氨基酸为Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ或Ｓｅｒ； Ｂ、当取代发生在第二环区时，在９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５或１０６位的一个或多个位置上发生取代，其中 ａ．取代发生在第９４位时，取代氨基酸为Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ或Ｓｅｒ； ｂ．取代发生在第９５位时，取代氨基酸为Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ或Ｖａｌ ｃ．取代发生在第９６位时，取代氨基酸为Ｇｌｎ或Ｓｅｒ； ｆ．取代发生在第９９位时，取代氨基酸为Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ或Ｓｅｒ； ｈ．取代发生在第１０１位时，取代氨基酸为Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ或Ｓｅｒ； ｉ．取代发生在第１０２位时，取代氨基酸为Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ或Ｓｅｒ； ｊ．取代发生在第１０３位时，取代氨基酸为Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ或Ｓｅｒ； ｌ．取代发生在第１０５位时，取代氨基酸为Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ或Ｔｈｒ；和 ｍ．取代发生在第１０６位时，取代氨基酸为Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ或Ｖａｌ； Ｃ、当取代发生在第三环区时，在１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１或１３２位的一个或多个位置上发生取代，其中 ａ．取代发生在第１２５位时，取代氨基酸为Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ或Ｖａｌ； ｂ．取代发生在第１２６位时，取代氨基酸为Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ或Ｓｅｒ ｄ．取代发生在第１２８位时，取代氨基酸为Ａｓｎ、Ｇｌｎ或Ｓｅｒ； ｇ．取代发生在第１３１位时，取代氨基酸为Ａｓｐ或Ｇｌｕ；…。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及用于各种清洗组合物的新的酶变异体，以及编码这些酶变异体的DNA序列。
技术介绍
酶构成了最大一类的天然存在蛋白质。每种类型的酶通常催化(促进反应而本身不被消耗)不同种类的化学反应。已知一类称为蛋白酶的酶能水解(将化合物分解为两个或多个简单化合物，并在裂解的化学键的每一端摄取水分子的H和OH部分)其它蛋白质。已通过将天然存在的和蛋白质工程化的蛋白酶作为添加剂搀入到洗衣洗涤剂中对这种水解蛋白质的能力加以利用。衣物上所许多污渍是蛋白质性的污渍，特异性广的蛋白酶能基本上除去这些污渍。遗憾的是，通常这些蛋白在它们天然细菌环境中的效力水平不能转移到相对非天然的洗涤环境中。特别是当不在这些酶的天然环境中使用时，蛋白酶的性质如热稳定性、pH稳定性、氧化稳定性和底物特异性不是需要的最佳状态。蛋白酶的氨基酸序列决定了蛋白酶的性质。蛋白酶氨基酸序列的改变可以不同程度地改变酶的性质、甚至可使酶失活，这取决于氨基酸序列中改变的位置、性质和/或程度。已采取了一些措施改变野生型蛋白酶的氨基酸序列以试图改善它们的性质，目标在于增强蛋白酶在洗涤环境中的效力。这些措施包括改变氨基酸序列以在非常多样的环境中增强热稳定性和改善氧化稳定性。尽管现有技术中描述了各种方法，仍继续需要新的有效的蛋白酶变异体，用于清洗各种表面。专利技术目的本专利技术的一个目的是提供枯草杆菌蛋白酶DY酶变异体，它们与野生型酶相比具有改善的水解作用。本专利技术的另一个目的是提供包含这些枯草杆菌蛋白酶变异体的清洗组合物。概述本专利技术涉及枯草杆菌蛋白酶DY变异体，它们是对野生型枯草杆菌蛋白酶DY氨基酸序列中某些氨基酸序列进行改良，野生型氨基酸序列包含第一环区、第二环区、第三环区、第四环区和第五环区；其中改良的氨基酸序列是在一个或多个环区内特定识别位置上包括与野生型枯草杆菌蛋白酶DY不同的氨基酸(即取代)，由此，枯草杆菌蛋白酶DY变异体与野生型枯草杆菌蛋白酶DY相比对不溶性底物具有降低的吸附作用和增强的水解作用。本专利技术还涉及编码这种枯草杆菌蛋白酶DY变异体的DNA序列。本专利技术也涉及包含该枯草杆菌蛋白酶DY变异体的用于清洗各种表面的组合物。详述I.枯草杆菌蛋白酶DY变异体本专利技术涉及枯草杆菌蛋白酶，特别是枯草杆菌蛋白酶DY，其通过突变编码该酶的各种核苷酸序列改变酶的氨基酸序列而已得到改良。本专利技术改良的枯草杆菌蛋白酶(下文即“枯草杆菌蛋白酶DY变异体”)与野生型枯草杆菌蛋白酶相比对不溶性底物具有降低的吸附作用和增强的水解作用。本专利技术还涉及编码这些枯草杆菌蛋白酶DY变异体的DNA序列。本专利技术的枯草杆菌蛋白酶属于蛋白酶类。蛋白酶是裂解肽键的催化剂。蛋白酶中的一类是丝氨酸蛋白酶。丝氨酸蛋白酶的特征是在活性位点有一个必需的丝氨酸残基。酶对可溶性底物的水解速率随酶浓度而增加，有许多文件资料证明了这个观察结果。因此看来，对于如在许多清洗情况中遇到的表面结合的底物而言，水解速率会随表面浓度的增加而增加似乎是合理的。已经证明事实是这样的。(Brode，P.F.III和D.S.Rauch，LANGMUIR，“枯草杆菌蛋白酶BPN′对固定化底物的活性(Subtilisin BPN′Activity onan immobilized Substrate)”，第8卷，1325-1329页(1992))。事实上，对于不溶性底物来说，当酶的表面浓度改变时发现水解速率与表面浓度呈线性依赖关系。(Rubingh，D.N.和M.D.Bauer，“蛋白酶在蛋白-溶液界面的水解催化作用(Catalysis of Hydrolysis by Proteases atthe Protein-Solution Inerface)”，聚合物溶液，混合物与界面(InPolymer Solutions，Blends and Interfaces)，I.Noda和D.N.Rubingh，Elsevier编，464页(1992))。令人惊讶的是，在试图应用这一原理寻找具有更好清洗效果的变异蛋白酶时，我们没有发现吸附越好性能越好的酶。事实上，我们意外地测定到了相反的情况酶对底物吸附作用降低导致底物的水解作用增加(即清洗效果更好)。当不拟受理论的限制时，认为当一种变异体与另一种比较时，改善的性能是源于这样一个事实，即酶吸附作用越小结合紧密性也越小，由此在不溶性蛋白底物要被除去的表面上的流动性更大。在相当的酶溶液浓度下，这种增强的流动性足以胜过任何通过对表面施加更高的酶浓度而赋予的优越性。此处所述的突变被指定为改变(即降低)酶对表面结合污物的吸附作用。在枯草杆菌蛋白酶DY中，某些氨基酸形成了酶分子的外部环。为便于讨论，这些环被称为第一、第二、第三、第四和第五环区。具体而言，位置58-65形成第一环区；位置94-106形成第二环区；位置125-132形成第三环区；位置153-166形成第四环区；位置186-190形成第五环区；位置199-219形成第六环区(位置编号与野生型枯草杆菌蛋白酶DY的氨基酸序列(SEQ ID NO1)中的位置相同)。据信，这些环区在酶分子对表面结合肽的吸附中起重要作用，在一个或多个这些环区中的特定突变对这种吸附作用会有重要影响。当不拟受理论限制时，认为环区对枯草杆菌蛋白酶DY分子的吸附作用是重要的，至少有两个原因第一，构成环区的氨基酸可以与酶分子作用的任何表面紧密接触。第二，环区与枯草杆菌蛋白酶DY分子的活性位点和结合空穴间的邻近使得它们在酶对表面结合底物(肽/蛋白质污物)的催化产生的吸附中起作用。这里所用的“变异体”指具有与野生型不同的氨基酸序列的酶。这里所用的“突变型枯草杆菌蛋白酶DY DNA”指编码枯草杆菌蛋白酶DY变异体的DNA序列。这里所用的“野生型枯草杆菌蛋白酶DY”指SEQ ID NO1表示的酶。枯草杆菌蛋白酶DY的氨基酸序列由Nedkov，P.，Oberthur，W.和Braunitzer，G.，在生物化学第366卷第421-430页(BIOL.CHEM.，Vol.366，pp.421-430(1985))作了进一步描述，在此引作参考。这里所用的“枯草杆菌蛋白酶DY野生型氨基酸序列”包括SEQ IDNO1以及除下列任一位置之外具有改变的氨基酸序列的SEQ IDNO1，所指位置包括58、59、60、61、62、64、65、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、125、126、127、128、129、130、131、132、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、186、187、188、189、190、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218或219。这里所用的“亲水性更强的氨基酸”指比目标氨基酸具有更强亲水性的任一其他氨基酸，参考下表所示的亲水性。下面亲水性表(表1)中以亲水性增强的次序由上向下列出氨基酸(参见Hopp，T.P.，和Woods，K.R.，“由氨基酸序列推测蛋白抗原决定簇(Prediction of ProteinAntigenic 本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：P·F·布罗德三世，B·L·巴尔内特，D·N·鲁宾，
申请(专利权)人：普罗格特甘布尔公司，
类型：发明
国别省市：
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