人类趋化因子β-8,趋化因子β-1和巨噬细胞炎性蛋白-4制造技术

本文公开了人类Ｃｋβ－８、ＭＩＰ－４、Ｃｋβ－１和编码这些趋化因子多肽的ＤＮＡ（ＲＮＡ）以及通过重组技术产生这些多肽的方法。本文也公开了将这些趋化因子多肽用于治疗白血病、肿瘤、慢性感染、自身免疫疾病、纤维变性障碍、创伤愈合和牛皮癣的方法。本文也公开了抗这些趋化因子多肽的拮抗剂和它们作为治疗风湿性关节炎、自身免疫、慢性及急性炎症、传染性疾病、过敏反应、不依赖于前列腺素的发热和骨髓失去功能的治疗剂的用途。本文还公开了检测与核酸序列突变有关的疾病和检测所说的多肽变化的浓度的诊断测定方法。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
,趋化因子β－1和巨噬细胞炎性蛋白－4的制作方法此申请是未决申请08/446,881(1995年5月5日在美国专利和商标局申请)的部分继续申请。本专利技术涉及新近鉴定的多核苷酸、由这些多核苷酸编码的多肽、这些多核苷酸和多肽的用途以及这些多核苷酸和多肽的产生。更具体地说，本专利技术的多肽已被推定性地鉴定为人类趋化因子β-8(Ckβ-8)、巨噬细胞炎性蛋白-4(MIP-4)和趋化因子β-1(Ckβ-1)。本专利技术也涉及抑制这些多肽的作用的方法。趋化因子，也称为intercrine细胞因子，是结构和功能相关的细胞因子的亚家族。这些分子的大小为8-10kd。一般来说，趋化因子在氨基酸水平上显示出20％至75％的同源性，以形成两个二硫键的四个保守的半胱氨酸残基为特征。以前两个半胱氨酸残基的排列为基础，将趋化因子分成两个亚家族，α和β。在α亚家族中，前两个半胱氨酸由一个氨基酸分开，因此称为″C-X-C″亚家族。在β亚家族中，这两个半胱氨酸在邻近的位置上，因此称为″C-C″亚家族。至此，在人类中已经鉴定了这个家族的至少8个不同的成员。intercrine细胞因子显示出各种功能。一个标志特征是它们引起不同细胞类型(包括单核细胞、嗜中性细胞、T-淋巴细胞、嗜碱细胞和成纤维细胞)的趋化迁移的能力。许多趋化因子具有促炎活性并且与炎性反应的多个步骤有关。这些活性包括组胺释放、溶酶体酶和白细胞三烯释放的刺激作用，增加靶免疫细胞吸附到内皮细胞上，增强补体蛋白的结合，诱导粒细胞吸附分子和补体受体的表达及突发性呼吸。除了和炎症有关外，已表明某些趋化因子显示出其它活性。例如，巨噬细胞炎性蛋白-1(MIP-1)能够抑制造血干细胞的增殖，血小板因子-4(PF-4)是有力的内皮细胞生长抑制物，白介素-8(IL-8)促进角化细胞的增殖，而GRO是黑素瘤细胞的自分泌生长因子。根据多样化的生物活性，趋化因子和很多生理和疾病状态(包括淋巴细胞运输、创伤愈合、造血调节和免疫紊乱(如变态反应、气喘和关节炎))有关，这一点并不奇怪。造血谱系调节物的例子是MIP-1。原来将MIP-1鉴定为巨噬细胞产生的内毒素诱导的促炎细胞因子。后来的研究表明MIP-1由两种不同的，但是相关的蛋白质MIP-1α和MIP-1β组成。MIP-1α和MIP-1β都是巨噬细胞、单核细胞和T淋巴细胞的化学引诱物。有趣的是，多潜能干细胞抑制物(SCI)的生物化学纯化和接下来的序列分析表明SCI和MIP-1α相同。并且，已表明MIP-1β能抵消MIP-1α抑制造血干细胞增殖的能力。此发现导致了这样一个假说，即MIP-1的主要生理作用是调节骨髓的造血，而所提出的炎性功能是次要的。MIP-1α作为干细胞抑制物的作用方式与其在G1/S核分裂间期阻断细胞周期的能力有关。并且，MIP-1α的抑制作用似乎受未成熟的祖先细胞限制，而其在粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSP)存在的情况下对晚期的祖先具有真正的刺激作用。已经克隆了几组趋化因子，它们可能是MIP-1α和MIP-1β的人类同系物。在所有的情况下，从针对激活的T细胞RNA制备的文库中分离cDNA。可以在早期的创伤炎症细胞中检测MIP-1蛋白，已表明MIP-1蛋白诱导创伤成纤维细胞产生IL-1和IL-6。此外，当或者皮下注射到小鼠的脚垫(footpad)上，或者脑池内注射到兔的脑脊髓液中时，天然的纯化MIP-1(包括MIP-1、MIP-1α和MIP-1β多肽)引起急性炎症(Wolpe和Cerami，1989，FASEB J.32565-73)。除了MIP-1的这些直接或间接的促炎性质外，在使用无菌伤口室的实验小鼠模型中，在伤口愈合的早期炎性阶段，重新获得MIP-1(Fahey，等，1990，细胞因子，292)。例如，PCT申请WO92/05198(由Chiron公司申请)公开了一种在酵母中作为产生哺乳动物巨噬细胞炎性蛋白(MIPS)模板的活性DNA分子。鼠MIP-1α和MIP-1β是不同的但十分相关的细胞因子。这两种蛋白质的部分纯化混合物影响嗜中性功能并引起局部的炎症和发热。已在酵母细胞中表达了MIP-1α并将其纯化成同质性。结构分析确认了MIP-1α与PF-4和IL-8具有相似的二级和三级结构，并与它们共有限定的序列同源性。也证明了MIP-1α在体内是活性的，保护小鼠的干细胞，防止后来其在体外由氚化的胸苷杀死。也表明MIP-1α促进更多的定型祖先粒细胞巨噬细胞集落形成细胞在响应粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的增殖(Clemens.J.M.等，细胞因子，476-82(1992))。原来在母专利申请中称为MIP-1γ的本专利技术的多肽(Ckβ-1)，基于氨基酸序列的同源性其为β趋化因子家族的新成员。原来在母专利申请中称为MIP-3的Ckβ-8多肽，基于氨基酸序列的同源性也是β趋化因子家族的新成员。按照本专利技术的一个方面，其提供了新的成熟多肽，它们是人类Ckβ-8、人类MIP-4和人类Ckβ-1以及它们的具有生物学活性并且诊断或治疗上有用的片段、类似物及衍生物。按照本专利技术的另一个方面，其提供了编码这些多肽的分离的核酸分子，包括mRNA、DNA、cDNA、基因组DNA以及它们具有生物学活性的和诊断或治疗上有用的片段、类似物及衍生物。按照本专利技术的另一个方面，其提供了通过重组技术产生这些多肽的方法，这一方法包括在促进所说的蛋白表达的条件下培养包含核酸序列的重组原核生物和/或真核生物的宿主细胞，并回收所说的蛋白质。按照本专利技术的另一个方面，其提供了这些多肽或编码这些多肽的多核苷酸用于治疗目的的方法，例如保护骨髓干细胞防止其在化疗期间受到化学治疗试剂的损害，除去白血病细胞，刺激免疫反应，调节造血和淋巴细胞的运输，治疗牛皮癣、固体肿瘤，促进宿主针对有抵抗力的慢性和急性感染的防御，和刺激创伤愈合。按照本专利技术的另一个方面，其提供了抗这些多肽的抗体。按照本专利技术的另一个方面，其提供了这些多肽的拮抗剂，它们可用于抑制这些多肽的作用，例如抑制IL-1和TNF-α的产生，治疗再生障碍性贫血、脊髓发育不良综合征、哮喘、关节炎。按照本专利技术的另一个方面，其提供了包含足够长度的核酸分子的核酸探针，以便特异性地和Ckβ-8、Ckβ-1和MIP-4核酸序列杂交。按照本专利技术的另一个方面，其提供了检测与这些多肽表达不足和过量表达有关的疾病以及检测编码这些多肽的核酸序列的突变的诊断测定方法。按照本专利技术的另一个方面，其提供了为了开发用于治疗人类疾病的治疗剂和诊断剂这一目的，将这些多肽或编码这些多肽的多核苷酸作为与科学研究、DNA合成和DNA载体制造有关的体外研究试剂的方法。通过本文的教导，本领域的技术人员应该清楚本专利技术的这些和其它方面。下列附图用来说明本专利技术的实施方案，而无意于用来限制权利要求所限定的本专利技术的范围。附图说明图1是编码Ckβ-8的cDNA序列和相应的推定的氨基酸序列。开始的21个氨基酸代表推定的前导序列。所有的信号序列通过杆状病毒表达的蛋白质的N末端肽测序而确定。图2是编码Ckβ-1的cDNA序列和相应的推定的氨基酸序列。开始的19个氨基酸代表前导序列。图3是编码MIP-4的cDNA序列和相应的推定的氨基酸序列。开始的20个氨基酸代表前导序列。图4显示了Ckβ-8(上面)和人类MIP本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的多核苷酸，这种多核苷酸包含选自由下列物质组成的组的成员：（ａ）一种编码包含ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２的氨基酸－２１至氨基酸９９之多肽的多核苷酸；（ｂ）一种编码包含ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２的氨基酸１至氨基酸９９之多肽的多核苷酸； （ｃ）一种能够和（ａ）或（ｂ）的多核苷酸杂交且与（ａ）或（ｂ）的多核苷酸具有至少７０％相同性的多核苷酸；和（ｄ）一种（ａ）或（ｂ）的多核苷酸的多核苷酸片段。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：CA罗森，SM卢本，李浩东，MD艾德姆斯，
申请(专利权)人：人类基因组科学公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]