一种南美白对虾肝胰腺坏死症LAMP检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种南美白对虾肝胰腺坏死症LAMP检测试剂盒，包括以下试剂：DNA提取试剂、引物、扩增体系试剂和DNA标准品。本发明专利技术提高了南美白对虾肝胰腺坏死症AHPND检测的效率和灵敏度，保证南美白对虾养殖过程中苗种或成虾该病原的有效监测，降低养殖风险，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种南美白对虾肝胰腺坏死症LAMP检测试剂盒
本专利技术属于对虾疾病检测领域，特别涉及一种南美白对虾肝胰腺坏死症LAMP检测试剂盒。
技术介绍
自2009年，对虾急性肝胰腺坏死症(Acutehepatopancreasnecrosissyndrome，AHPNS)首先在我国海南被发现，随后越南、泰国、马来西亚和菲律宾都先后暴发了AHPNS，泰国等地减产十分严重。2011年起，我国广东、广西等华南主产区受AHPNS影响减产严重。凡纳滨对虾发生AHPNS后体色发白，虾壳变软，摄食明显减少，活力减弱，行动迟缓，少数对虾体表出现黑斑；肝胰腺颜色暗淡苍白或糜烂发红，部分对虾的肝胰腺明显萎缩或者异常肥大，空肠空胃。苗种投放苗10天后就可发病死亡,濒死虾不很少出现在池边或水面。迄今为止，AHPNS只发生于凡纳滨对虾、斑节对虾和中国明对虾，对虾放苗7天后便出现死亡。已有的研究显示，在对虾苗期、幼虾阶段等都能检测到病原的存在。但近几年来，AHPNS也发生于成虾，放苗60天后常有发生。调查发现，AHPNS主要发生于水温在20-25℃间，放养密度高的池塘发病率明显高于密度低的池塘，养殖集中区域发病率较高，单养池塘的对虾患病机率和受影响程度均高于虾鱼混养池塘。PirvpAB基因编码的二元毒素是病原弧菌的主要毒力因子，产生的二元毒素结构与苏云金芽孢杆菌所产生的伴孢晶体结构相似，毒力效应也与苏云金芽孢杆菌Cry蛋白毒力作用相似，都表现为插入宿主细胞膜上形成穿模孔洞，细胞内外渗透压发生改变，使靶细胞损伤甚至死亡。传统的显色培养基技术无法区分正常弧菌和变异弧菌，不能为AHPNS病原的检测提供支持。而PirvpAB基因的测序完成，为有效的检测手段的开发提供了基础。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种南美白对虾肝胰腺坏死症LAMP检测试剂盒，该试剂盒提高了南美白对虾肝胰腺坏死症AHPND检测的效率和灵敏度，保证南美白对虾养殖过程中苗种或成虾该病原的有效监测，降低养殖风险，有良好的应用前景。本专利技术提供了一种南美白对虾肝胰腺坏死症LAMP检测试剂盒，包括以下试剂：DNA提取试剂、引物、扩增体系试剂和DNA标准品；其中，所述引物的具体序列如下：F3：5'-GGGATCAAGGACGAAGGCT-3'；B3：5'-CAGCACAATCCACTCCTGG-3'；FIP：5'-AAGCATCGCTCTCGCAACACC-ACACCGCTGTAGTTCTAGCA-3'；BIP：5'-TTCGGGCTCTGGGGATAGTACG-GTCCTTCCGTCAATTTCGCT-3'。所述扩增体系试剂包括dNTPs混合物，甜菜碱，Mg2+，BstDNA聚合酶和羟基萘酚蓝染料。进一步的，所述扩增体系试剂包括2mM的dNTPs混合物，0.8M的甜菜碱，6mM的Mg2+，0.16U/μL的BstDNA聚合酶和130μM的羟基萘酚蓝染料。所述DNA标准品为肝胰腺坏死症DNA。所述试剂盒用肉眼判别检测结果，阴性结果体系的颜色与反应颜色一致为紫罗兰色，阳性结果由紫罗兰色变为天蓝色。进一步的，所述试剂盒的扩增体系为：在200μLPCR管中加入终浓度为2mM的dNTPs混合物，0.8M的甜菜碱，6mM的Mg2+，0.8μM的FIP和BIP，0.2μM的F3和B3，0.16U/μL的BstDNA聚合酶，130μM的羟基萘酚蓝染料和3ng/μL的DNA模版，用ddH2O补齐至总体积25μL。进一步的，所述试剂盒的扩增程序为：将混合好的体系闭管密封，离心后65℃水浴扩增60min，80℃10min终止反应。有益效果(1)本专利技术提高了南美白对虾肝胰腺坏死症AHPND检测的效率和灵敏度，保证南美白对虾养殖过程中苗种或成虾该病原的有效监测，降低养殖风险；(2)本专利技术降低了急性致死性弧菌检测对大型昂贵仪器的依赖，简化了常规PCR检测繁琐的操作流程；(3)本专利技术检测结果可以通过肉眼辨别，结果直观明了；(4)本专利技术采用闭管检测和结果观察，避免扩增中形成气溶胶污染，降低了假阳性结果出现的风险，对南美白对虾肝胰腺坏死症AHPND的监测有良好的应用前景。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1本实施例提供了一种南美白对虾肝胰腺坏死症LAMP检测试剂盒，包括以下试剂：DNA提取试剂、引物、扩增体系试剂、DNA标准品(用量为1次以上，优选为10-15次用量)；其中，所述引物的具体序列如下：F3：5'-GGGATCAAGGACGAAGGCT-3'；B3：5'-CAGCACAATCCACTCCTGG-3'；FIP：5'-AAGCATCGCTCTCGCAACACC-ACACCGCTGTAGTTCTAGCA-3'；BIP：5'-TTCGGGCTCTGGGGATAGTACG-GTCCTTCCGTCAATTTCGCT-3'。DNA提取试剂可以为常规的DNA提取试剂，扩增体系试剂主要包括dNTPs混合物，甜菜碱，Mg2+，BstDNA聚合酶，羟基萘酚蓝染料等，各试剂分开单独存放。DNA标准品为肝胰腺坏死症(AHPND)DNA。进一步的，扩增体系试剂包括2mM的dNTPs混合物，0.8M的甜菜碱，6mM的Mg2+，0.16U/μL的BstDNA聚合酶和130μM的羟基萘酚蓝染料。实施例2本实施例提供了一种南美白对虾肝胰腺坏死症LAMP检测试剂盒的检测步骤，具体如下：1)南美白对虾样品的采集用消毒处理的器具将南美白对虾(苗种取200尾混合成一份样品，成虾以单独个体为一份样品)取至无菌封口袋，冷藏或冷冻带回。2)样品DNA提取苗种样品直接进行研磨，成虾取肝胰腺组织作为样品进行研磨，将30mg研磨后的样品转移到消毒处理的1.5mL离心管中，通过商品化的DNA提取试剂盒(磁珠法动物基因组DNA抽提试剂盒(Mag-MKAnimalGenomicDNAextractionkit，上海生工))提取样品DNA作为LAMP扩增模版。3)引物的设计利用PrimerExplorer4软件，以公开的肝胰腺坏死症(AHPND)ssurRNA基因序列(GenBank登录号FJ496356)为模板设计引物。4)扩增体系配制和扩增在200μLPCR管中加入终浓度为2mM的dNTPs混合物，0.8M的甜菜碱，6mM的Mg2+，0.8μM的FIP和BIP，0.2μM的F3和B3，0.16U/μL的BstDNA聚合酶，130μM的羟基萘酚蓝染料和3ng/μL的DNA模版，用ddH2O补齐至总体积25μL。将混合好的体系闭管密封，离心后65℃水浴扩增60min，80℃10min终止反应。5)结果观察。取出PCR管肉眼判别检测结果，阴性结果体系的颜色与反应颜色一致为紫罗兰色，阳性结果由紫罗兰色变为天蓝色。实施例3灵敏度测定1)肝胰腺坏死症(AHPND)DNA提取：挑取肝胰腺坏死症(AHPND)阳性样品，通过商品化的DNA提取试剂盒(磁珠法动物基因组DNA抽提试剂盒(Mag-MKAnimalGenomicDNAextractio本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种南美白对虾肝胰腺坏死症LAMP检测试剂盒，其特征在于：包括以下试剂：DNA提取试剂、引物、扩增体系试剂和DNA标准品；其中，所述引物的具体序列如下：F3：5'‑GGGATCAAGGACGAAGGCT‑3'；B3：5'‑CAGCACAATCCACTCCTGG‑3'；FIP：5'‑AAGCATCGCTCTCGCAACACC‑ACACCGCTGTAGTTCTAGCA‑3'；BIP：5'‑TTCGGGCTCTGGGGATAGTACG‑GTCCTTCCGTCAATTTCGCT‑3'。

【技术特征摘要】
1.一种南美白对虾肝胰腺坏死症LAMP检测试剂盒，其特征在于：包括以下试剂：DNA提取试剂、引物、扩增体系试剂和DNA标准品；其中，所述引物的具体序列如下：F3：5'-GGGATCAAGGACGAAGGCT-3'；B3：5'-CAGCACAATCCACTCCTGG-3'；FIP：5'-AAGCATCGCTCTCGCAACACC-ACACCGCTGTAGTTCTAGCA-3'；BIP：5'-TTCGGGCTCTGGGGATAGTACG-GTCCTTCCGTCAATTTCGCT-3'。2.根据权利要求1所述的一种南美白对虾肝胰腺坏死症LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述扩增体系试剂包括dNTPs...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈辉，乔毅，万夕和，蒋葛，范贤平，王李宝，史文军，黎慧，
申请(专利权)人：江苏省海洋水产研究所，
类型：发明
国别省市：江苏,32