用于生产单性果实和蔬菜的转基因方法和组合物技术

本发明专利技术公开了用于生产单性果实或具有减少的种子数目的果实的转基因方法，它涉及暂时表达植物激素或其前体或其他这样的基因以便加强参与启动着果活性的赤霉素或其他类似的激素活性。该具有可操作连接到调节启动子以便选择在花粉发育或授粉之前进行表达。激素的表达导致在没有受精的情况下果实发育。该方法也导致产生具有减少的或非常少的种子的果实。本发明专利技术也包括转基因构建体，载体，和用于生产单性结实植物的方法。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

总的来说，本专利技术涉及植物分子生物学领域，特别是涉及转基因植物，种子，和已经进行遗传修饰以产生越过受精的需要并且启动着果的植物的组织，其在各种各样生长条件下将会产生无籽果实和蔬菜。
技术介绍
对于被子植物，果实是从包围正在发育的种子的囊果皮发育的。果实的发育出现在授粉和受精之后，其结果产生胚。基于雄性配子与其他细胞在原卵中的融合，启动胚乳，随着原生质体胚的增殖同时发育。由于原卵发育为种子，子房扩展到果实。在非无性(nonapomicytic)种中通常果实的发育受原卵受精的激发，并且如果不出现授粉或受精，那么会发生花脱落并且不着果的情况。着果也受外部因素例如温度的变动，水的可得性，光条件的抑制。例如胡椒对温度变动非常敏感。在夜间温度低于50°F或白天温度高于80°F将会导致在授粉之后不着果。较小的变化将会导致参差不齐的着果，导致产生异常形状的水果。在植物中控制着果启动的能力可以避免这些问题，因为着果可以受内部控制，而不管外部因素如何，从而提高了产量以及潜在的生长面积。这样的控制也使在没有授粉的情况下进行着果，即生产单性结实表现型。这可以使植物不管外部因素如何都可以发育果实，并且可以不管授粉与否可以发育果实。单性结实表现型常常不仅允许在没有授粉的条件下着果，而且由于没有授粉，使种子发育降低到最小或完全被抑制，提供了单性结实的第二个益处。长期以来无籽果实和蔬菜是本领域内生产者追求的目标。所述植物的益处包括消费者对易于生产和消费所述产品的强力呼声。其他的益处包括由于没有种子腔或种子腔大大减少，果实或蔬菜更甜，肉质更厚，可食部分增加。通常由于局部使用激素或使用高度复杂的育种程序导致产生三倍体基因型，在本领域内已经显示了几个优点。长期以来局部使用赤霉素用于诱导葡萄的无籽(单性结实)表现型。该方法通常需要喷涂程序，因此，该方法是麻烦的，依赖于气候的，并且必须正确地控制时间，以便在授粉之后立即出现。另一种方法需要复杂的育种程序用于生产无籽西瓜。西瓜的无籽状态几乎总是每个细胞存在三种同源补体，而不是通常的两个的结果，已知为三倍体。这些西瓜在正常地发育为胚时出现了问题，并且导致在三倍体植物中不存在种子。异常胚的形成导致在早期阶段正常的原卵停止发育为种子。通常，无籽西瓜含有类似于未成熟黄瓜的、小的、可食用的白色原卵。世界专利WO91/09957已公开了制备无籽果实的转基因方法。该方法涉及称之为“CRE-LOX”的高度复杂的重组切除系统，通常CRE的基因产物产生了蛋白质重组酶，该酶在特定的LOX DNA序列中起作用。公开了几种重组功能与被切除的LOX DNA序列最一致。在该申请中假设无籽西瓜出现在涉及用来自于解淀粉芽孢杆菌的芽孢杆菌RNA酶的基因转化的状态。通常，雌性植株具有种子外壳特异性启动子(SC).CRE.终止子，雄性植株具有SC启动子芽孢杆菌RNA酶基因::lox::芽孢杆菌RNA酶基因::终止子。当繁殖时两个亲本没有表现型的变化，并且在种子生产领域内雌性种子亲本基因正常的种子座，因为两个基因在同一时间不发挥功能(种子外壳仅是母本的组织)。但是，在F1代母本组织将会含有两个基因。在该构型中，种子外壳的构成(F1植株，F2种子)是SC启动子芽孢杆菌RNA酶基因::-::芽孢杆菌RNA酶基因::终止子，其中::-::表示lox基因被切除的点，产生了特异于种子外壳的功能性毒素基因。在理论上，如果种子外壳破碎了，种子的发育将被抑制，因为营养物不能流到胚中。至今没有公开试验数据并且没有人证明所建议的方案成功地发育为实际的无籽西瓜。因此，从以上可以看到本领域内需要用于生产单性果实和蔬菜的方案，该方法应该是简单的，易做的和易于重复的。本专利技术的目的之一是提供了表达构建体，当在转基因植物中表达时，导致在没有授粉时产生着果并且也导致产生无籽果实和蔬菜。本专利技术的另一个目的是提供了能够回交的自交亲本系，导致产生单性结实的F1植株杂交，并且将不会产生种子或大量种子显著降低。本专利技术的又一目的是提供了含有本专利技术的表达构建体的植物，植物细胞和植物组织。本专利技术的还有一个目的是提供了用于转化植物细胞的载体包括病毒或质粒载体，以及掺入了本专利技术的基因和启动子的表达盒。本专利技术的再一个目的是提供了包括用于维持复制和植物转化的所述载体的细菌细胞。根据下面的描述，本专利技术的其他目的是显而易见的。专利技术概述本专利技术的一个实施方案包括对植物进行遗传操作以加强赤霉素或其他激素参与启动着果的作用。本专利技术包括编码植物激素例如(赤霉素，或细胞因子)或与启动着果的所述激素(即酶，生物合成中间体等)的生产相关的蛋白质的结构基因的暂时表达。将结构基因置于特异于花粉的小孢子或大孢子的启动子的控制下以便控制激素表达的时间使之在授粉之前出现，以便不需要受精而诱导果实的发育和成熟。专利技术详述局部使用外源性激素或者帮助着果，或在某些情况下诱导单性结实已在果实和蔬菜生长领域内得到充分的证实。在现有技术中已经完成了在寒冷的条件下在温室中使用植物生长激素抑制剂Tomaset(N-间-甲苯基-邻氨甲酰苯甲酸，或4-CPA)诱导番茄的单性结实。在佛罗里达的胡椒组织生长季节使用GA以提高着果。常规方法用赤霉素处理葡萄以诱导着果，增加束的大小，并且使果实均匀生长，尤其是对于无籽种类。参见例子，Jankiewicz,L.S.,Flores,A.E.,Gorecki,R.,Staniaszek,M，“生长调节剂对辣椒单性着果的作用”。利用额外的赤霉素处理以确保随着老的果实成熟，新的果实着果并且收获。参见，SO:Folia-Horticulturae(波兰)，(1991),v.3(2)第3～16页。在下面的说明书中广泛地使用了许多术语。提供下面的定义以便去除在说明书和权利要求书中使用该术语时不明确的目的和范围意义，并且有助于理解本专利技术。本文使用的术语赤霉素应该包括具有赤霉素的生物学特性的任何产品并且包括类似于赤霉素的蛋白质，所述蛋白质与赤霉素产品同源，以致于通过下文中讨论的突变研究维持生物学活性。本文使用的术语果实应该包括在其花中具有产生花粉和原卵的器官的被子植物；原卵包含于子房中，并且在受精之后，各个子房发育为种子，而子房扩展为果实。任何以单性果实方式产生的所需要的这样的果实包括在该定义中。此外，还计划包括传统认为的，但不是以该方式产生的食品来源的蔬菜例如番茄，胡椒等。启动子是指导结构基因的转录的DNA序列。通常将启动子定位于基因的5’区域，靠近结构基因的转录起始位点。花粉特异性启动子是指能够在授粉之前或之后不久调节暂时表达以致于诱导果实的发育和成熟，没有显著的种子发育的启动子。本文描述的启动子包括但不限于诱导性启动子，小孢子或大孢子启动子，花粉特异性启动子或母本组织启动子例如种子外壳启动子或与参与授粉或原卵成熟或发育的基因有关的任何其他启动子。结构基因是被转录为信使RNA(mRNA)的DNA序列，然后转译为特定的多肽的氨基酸特性的序列。术语表达是指基因产物的生物合成。对于结构基因的情况，表达涉及结构基因转录为mRNA，然后mRNA转译为一个或多个多肽。克隆载体是诸如质粒，粘粒或细菌噬菌体的一个DNA分子，该分子具有在宿主细胞中自主复制的能力。通常克隆载体含有一个或较小量的限制性核酸内切酶位点，在该本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于产生转基因的单性结实植物的表达构建体，它包括一个重组基因和可操作连接到所述基因的花粉特异性启动子，基于表达所述重组基因编码植物激素，其前体或参与其生物合成的酶，其中所述的激素启动着果和／或发育。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：德怀特T托姆斯，保罗大卫米勒，罗伯特J本森，
申请(专利权)人：先锋高级育种国际股份有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]