交叉保护性马疱疹病毒制品及其制备和使用方法技术

一种单价的ＥＨＶ－１疫苗，对与ＥＨＶ－１和ＥＨＶ－４有关的疾病提供保护作用。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种马疱疹病毒制品，该制品能对由1型马疱疹病毒引起的流产和呼吸疾病以及由4型马疱疹病毒引起的呼吸疾病提供保护作用。更为具体地说，本专利技术涉及一种有效的疫苗及其制备和使用方法。
技术介绍
马的流产和马鼻肺炎是由于1型马疱疹病毒(EHV-1)和2型马疱疹病毒引起的常见病。目前由于已确定2型马疱疹病毒的分子结构与EHV-1存在显著性差别而将其命名为EHV-4。EHV-1是造成呼吸疾病的主要原因。由于幼马的各种亚型的EHV而引起了呼吸疾病，其结果使这些马参于竞争的能力丧失或受到削弱，从而造成了经济上的损失。怀孕母马的感染所造成的经济损失的原因在于其流产。中枢神经系统综合征也与EHV-1有关，这种疾病的发展是由逐步的瘫痪变为完全瘫痪，而且在某些情况下导致死亡。由于EHV-1和EHV-4之间缺乏同源性，因此有人提议只有含有EHV-1和EHV-4亚型的马疱疹病毒疫苗才可防止流产和各类呼吸疾病。事实上，美国专利4,083,958描述了一种仅对由EHV-1引起的流产和呼吸疾病有保护作用的马疱疹病毒疫苗。它没有声明对由EHV-4引起的呼吸疾病具有保护作用。美国专利5,084,271报导，如果使马驹接受EHV-1，不管该EHV-1是活的还是被灭活的，都会产生一种仅对EHV-1有反应的抗体。如果使马驹接受EHV-4，则对EHV-1和EHV-4都产生血清应答。但是，它没有表明对于攻击具有实际上的保护作用。后者的专利要求一种有效的疫苗必须是单独含有EHV-4或同时含有EHV-1和EHV-4。因此，可以预期单价的EHV-1疫苗对于EHV-1和EHV-4呼吸综合症以及由EHV-1引起的流产没有保护作用。专利技术概述本专利技术包括一种被命名为AB69的亚型1马疱疹病毒(EHV-1)株或它的等效株，该株可用于制备能诱导产生对EHV-1和EHV-4具有保护性免疫反应的抗原。本专利技术还包括制备一种含有AB69的单价疫苗，该疫苗可用于对年幼的马驹、成年马或怀孕母马进行接种以提供对由于EHV-1或EHV-4引起的呼吸疾病的保护作用，以及提供对由于EHV-1引起的流产的保护作用。本专利技术进一步包括一种制备和使用该制品对马进行保护的方法。可以预想本专利技术的疫苗制品还能提供对由EHV-1引起的中枢神经系统疾病的保护作用。在本专利技术实施方式中，本专利技术包括制备这种单价EHV-1疫苗的方法，该方法通过下列步骤进行在连续的细胞培养物上繁殖AB69株或其等效株、收集并通过除去病毒上清中的细胞碎片而进行纯化、浓缩、化学方法灭活和使用佐剂，下文对此进行更为全面地描述。专利技术详述如上所述，本专利技术涉及一种EHV-1病毒，如果将这种病毒制成某种制品如疫苗并用它对马进行非肠道给药，则会给所有马提供对与EHV-1和EHV-4有关的疾病的保护作用。更为具体地说，所公开的EHV-1疫苗保护怀孕母马免于由EHV-1引起的流产，保护马免于由EHV-1或EHV-4引起的呼吸疾病，并且降低由EHV-1引起的中枢神经系统疾病的发病率。用于制备这种疫苗的EHV-1病毒株是在攻击研究过程中从被感染的流产胎的肺组织分离出来的。已将命名为AB69的该分离物保藏于ATCC，保藏号为＿＿。使该病毒在马的皮肤细胞系上传代两次而建立一种主接种物。该病毒可在允许其复制到足够水平的敏感细胞系中生长，以提供免疫致敏足够的抗原物质，从而产生对EHV-1和EHV-4的保护作用。以下对复制病毒及以其制备疫苗的方法进行非限制性地和例证性地描述。该方法包括以下步骤1)用EHV-1病毒感染敏感细胞系；2)使所述的EHV-1病毒在支持生长的培养基中进行生长直至产生显著的细胞病变效应(CPE)；3)收集所述的含有所述EHV-1病毒、死细胞、细胞碎片和被感染细胞的支持生长的培养基而得到收集物质；4)采用合适的灭活剂对所述的收集物质进行灭活；和5)在所述的被灭活的收集物质中加入佐剂。该敏感细胞系优选来源于马，更优选来源于马皮肤细胞系、马肾细胞系或马胎的肺细胞系。将该细胞系用于使EHV-1株生长至高滴度。可使该细胞系作为一种悬浮培养物在扁瓶、滚瓶或生物反应器中或在微载体珠上生长，使用有助于细胞快速生长的任何培养基和血清。优选的培养基为加有谷氨酰胺和非必需氨基酸的Earle’s或Hank’s极限必需培养基(分别为MEME和MEMH)。优选的用于细胞生长的血清为胎马、胎牛或牛犊的血清。使该细胞系生长至汇合，接着用EHV-1病毒感染该细胞系，所用感染复数(MOI)为在每毫升的培养基中产生最大的感染病毒粒子产量。优选的MOI介于0.0001到0.1之间。使被感染的细胞系生长至这些细胞显示出显著的细胞病变效应(CPE)。将显著的CPE定义为＞80％的细胞被破坏，在显微镜下可见死亡细胞从微载体珠生长容器的表面脱落。通过以下方法收集含有被感染细胞、死亡细胞、细胞碎片和EHV-1的培养基将该培养基从其生长的容器中移出，并将其转移到储存罐如水箱或袋中。通过过滤或离心除去细胞和细胞碎片而将该收集物质纯化，接着通过超滤、超速离心分离或柱色谱法将上清液浓缩。通过向该浓缩的液体中加入保持病毒抗原性的任何灭活剂而将其灭活。优选的灭活剂为β-丙内酯、福尔马林或二元氮丙啶。可向该被灭活的液体中加入防腐剂如乙基汞硫代水杨酸钠。在灭活之后，向该被灭活的物质中加入佐剂。可用任何数量的佐剂，它包括但不限于Carbopol 934P、Havlogen、PolygenTM、嵌段共聚物、聚合物、油、铝盐如氢氧化铝和磷酸铝、细胞因子、免疫调节剂以及它们的组合物。在加入佐剂之后，可以加入稳定剂如甘油/EDTA以改善抗原的稳定性。本领域技术人员认识到一旦病毒可以如上所述进行繁殖，则可以通过本领域中公知的方法如从病毒中提取而获得它们的包括亚单位的衍生物。而且，可以在分子水平鉴定该保护性抗原并采用重组技术来对该抗原进行复制和表达。通过以下实施例来对本专利技术进行进一步地解释，但这并不意味着本专利技术限于这些实施例，其中除非特别说明，所有的份数和百分数都以重量计。实施例实施例1在1750cm2的滚瓶中采用MEME+10％的胎牛血清使马的皮肤细胞系生长至大约有90％发生汇合。用命名为AB69的EHV-1株感染汇合细胞并将其转移到含有非必需氨基酸、谷氨酰胺、硫酸新霉素和(多粘菌素)的(MEME)中。将被感染的细胞培养物在37℃下培养三至六天或直至产生90-95％的CPE，接着将这些细胞和液体在无菌条件下收集到单一容器中。然后通过5μ滤器过滤使该收集物质澄清，并通过100,000MW柱体超滤而浓缩五倍。通过以下步骤对被浓缩的液体进行灭活将pH调整至8.0至8.3，加入β-丙内酯至终浓度在0.05％到0.15％之间，并在37℃下温育三至六小时，在此期间用10N的NaOH调节pH在6.8到7.2之间。后一温育使β-丙内酯发生水解。在灭活结束后，向该液体中加入佐剂Havlogen，加入乙基汞硫代水杨酸钠作为防腐剂而完成疫苗的生产。将这种方法生产的疫苗命名为EHV-1 MHD 91-001。进行疫苗接种/攻击研究以确定EHV-1 MHD 91-001是否能保护怀孕母马免于EHV-1呼吸疾病和由马疱疹病毒引起的流产。在这项研究中，将45只处在第二个三月怀孕期(平均在怀孕的第5个月)的母马分成两组本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：J·马瑟克，K·K·布朗，B·O·穆尔，
申请(专利权)人：美国拜尔公司，
类型：发明
国别省市：