用于病毒繁殖和增殖的培养基和方法技术

本发明专利技术涉及用于病毒的繁殖和增殖的培养基，其特征在于，它不含有人或动物蛋白，且它含有提取自马铃薯或黄瓜的具有促有丝分裂能力的蛋白或糖蛋白，其分子量为１０００至２０００００道尔顿和／或植物提取物的水解产物。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于在培养物中的细胞上进行病毒繁殖和增殖的培养基和方法、特别涉及用于产生疫苗的培养基和方法。生产病毒疫苗，无论它们是单纯减毒、失活的亚单位还是重组体均包括大规模病毒的生产。可以根据病毒的性质，在允许病毒复制的各种载体中，进行这种生产，因此，例如，对于大多数目前可商购的抗流感疫苗来说，在胚化鸡蛋上进行病毒增殖，而对于某些抗日本脑炎的疫苗来说，在小鼠脑上进行该步骤。然而，这类载体的应用有许多问题有效性、重复性、且特别是由病毒、支原体或来源于所述载体的任何其它不需要成分的可能的污染所导致的安全性问题。由此愈加进行各种尝试以便用这类载体来配制药品，且如果可能，可使用细胞培养物，所述培养物被欲生产的少量病毒感染然后被维持在可促进感染细胞内病毒复制以及使感染在细胞间扩散的条件下。接着当培养基中含有在出芽后离开细胞的(特别具有使得用相同培养细胞进行几次病毒收集成为可能的优点)胞内病毒时，从浸有细胞的所述培养基中收集所产生的病毒；或当细胞中含有胞内病毒时通过处理细胞自身而从所述培养基中收集所产生的病毒。这些技术要求拥有良好质量的细胞培养物；现有技术中的许多开发研究由此涉及改进细胞培养物且特别是改进所用的培养基。为了限制由支原体、病毒、牛海绵状脑病致病因子或任何其它非常规传染因子污染细胞所导致的危害，正如专利申请WO 96/15231中所述。已经提出使用不含血清且甚至不含蛋白质的培养基，另一方面，法国专利申请FR 2,732,347中提出了使用不含动物血清而含有植物提取物的细胞培养基。因此，由于将这类培养基用于细胞培养步骤，所以使用由此产生的细胞所获得的产品的安全性得到了提高。然而，当生产形成疫苗组合物的一部分的病毒是首要问题时，对于这种细胞培养期来说是连续的步骤自身也应表现出最大程度的安全性。具体地说，通常且如美国专利4525349中所述，当将培养物中的细胞用于生产病毒时，一旦已经进行到细胞培养期，则除去用于细胞培养的培养基，然后用一种新的培养基取代，在所述的新培养基中将细胞浸没片刻以便进行洗涤；接着除去这种新培养基；可以将这种细胞洗涤程序任意重复一定的次数。接下来，将新培养基引入细胞培养物，该步骤使得细胞首先能存活下来并被病毒感染，且随后使细胞带有足以成为这些病毒复制的载体的处理成分。然而，正如论文“Vero细胞的不含蛋白质的培养物用作人病原体病毒复制的底物”中所述(Cell国际细胞生物学，Vol.17 No.9,1993,pp.885-895)，甚至当在不含蛋白质的培养基中进行细胞培养时，现有技术在这种病毒增殖和繁殖步骤中所用的培养基中通常含有胎牛血清或至少是人清蛋白以限制污染问题。人们认为在制备病毒疫苗之方法的该步骤中使用人清蛋白对疫苗的质量没有危险。然而，为了完全消除所有的危险(甚至在理论上)，需要拥有一种适于病毒在由培养物中的细胞组成的载体上繁殖和增殖的培养基，它不含人或动物蛋白、甚至不含重组体来源的蛋白质，而依然具有与工业化需求相适应的产量以便不会增加生产疫苗的成本，所述疫苗含有在培养物中细胞上产生的病毒。本专利技术的目的特别是提供这样一种培养基。本专利技术的另一个目的是提供一种用于病毒繁殖和增殖然后在需要时进行使病毒失活步骤的培养基和方法。为了达到这些目的，本专利技术的主题是一种用于在培养物中细胞上进行病毒繁殖和增殖的培养基，其特征在于它不含人或动物蛋白、甚至不含重组体来源的人或动物的蛋白质，因此它含有来源于植物的成分。根据本专利技术的一个特征，用于病毒繁殖和增殖的培养基中含有提取自马铃薯或黄瓜的蛋白质或糖蛋白，它们具有促有丝分裂潜能且具有1000-200,000道尔顿的分子量。根据一个特定的实施方案，本专利技术的培养基中包括植物水解产物。根据本专利技术的一个特殊的特征，所述的蛋白质或糖蛋白提取自马铃薯。根据本专利技术的另一个特征，所述的蛋白质或糖蛋白通过下列方式获得-洗涤并粉碎植物；-在含水介质中稀释；-对所获得的混合物进行热凝结；-通过层析法纯化。根据本专利技术的一个特征，通过化学和/或酶促方式水解原料诸如棉花、大豆、小麦或稻米来获得所述的植物水解产物。使用由QuestInternatinal公司提供的HyPepTM系列产品、特别是使用含有高比例的分子量小于1000道尔顿的肽类产品已经获得了特别良好的结果。根据另一个特征，本专利技术用于病毒繁殖和增殖的培养基特别适合于在Vero细胞上进行病毒增殖。根据另一个特征，本专利技术用于病毒繁殖和增殖的培养基特别适合于繁殖日本脑炎病毒、脊髓灰质炎病毒和狂犬病病毒。本专利技术的主题还是一种用于制备病毒疫苗的方法，该方法包括在培养物中细胞上产生病毒的步骤，其特征在于在存在有不含人或动物蛋白、甚至不含重组体来源的人或动物蛋白质而含有植物提取物的培养基的情况下进行病毒繁殖和增殖的步骤。通过阅读下列描述会更好地理解本专利技术。本专利技术的培养基和方法适合于生产能够在细胞培养物上复制的所有病毒。它们特别可以是属于下列类别的病毒正粘病毒、副粘病毒、呼肠孤病毒、细小核糖核酸病毒、黄病毒、沙粒病毒、疱疹病毒、痘病毒和腺病毒。它们还可以是重组体病毒。特别地，本专利技术特别适合于生产可以形成疫苗组合物之一部分、且特别是对安全性有最高要求的人体疫苗组合物之一部分的病毒。它们特别是脊髓灰质炎、狂犬病、日本脑炎、黄热病、风疹、流行性腮腺炎、登革热或麻疹的病毒、各种形式肝炎的病毒、AIDS或水痘的病毒、疱疹病毒、由呼吸道合胞病毒所导致的疾病的病毒、巨细胞病毒、EBV、轮状病毒或流感病毒。本专利技术特别有利于生产可导致脊髓灰质炎、狂犬病、日本脑炎、风疹、水痘、甲型肝炎、流感、登革热、麻疹或流行性腮腺炎的病毒。可以用于本专利技术病毒生产的细胞是可以在培养物中倍增并允许需要被生产的病毒透入的所有细胞。它们特别可以是Vero细胞、CV-1细胞、LLC-MK2细胞、MDCK细胞、MDBK细胞、WI-38细胞、MRC5细胞(人成纤维细胞)或BHK21细胞。使用Vero细胞培养物或MRC5细胞培养物已经获得了特别良好的结果。可以根据通常使用的不同技术在细胞培养箱中、摇瓶中、Roux培养瓶中、MultitraysTM中、Cell-CubesTM中来进行细胞培养。由于工业化的原因，优选使用由例如CytodexTM珠组成的微载体在细胞培养箱中进行细胞培养。可以在不同条件下特别是根据所用的培养基来进行这种细胞培养；尽管用于细胞生长期的培养基中含有血清或至少含有人或动物蛋白，但实际上能够完成本专利技术；当然，在这种情况中，必须在细胞被感染前对其进行彻底地洗涤，以便不会失去由于不存在污染危险而完成本专利技术所产生的优点。然而，应用使用不含人或动物来源的蛋白质的细胞培养基获得的细胞培养物是优选的。根据所用细胞和所生产病毒的性质，使用病毒接种物进行病毒感染的最合适的时机可以改变。一般来说，该步骤是在指数生长期的中期或在其结束时进行；实际上已经注意到在这些条件下获得的结果特别令人满意。根据本专利技术，用于病毒繁殖和增殖步骤的培养基是一种不含人、动物或重组体蛋白质而含有提取自马铃薯或黄瓜的具有促分裂潜能并具有1000-200,000道尔顿分子量的蛋白质或糖蛋白和/或植物提取物水解产物的培养基。这种培养基是一种可以含有通常用于病毒增殖的所有或部分成分的培养基，诸本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于在培养物中细胞上繁殖和增殖病毒的培养基，其特征在于它不含人和动物蛋白、甚至不含重组体来源的人或动物蛋白质；还在于它含有植物提取物。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：P黑明丁格，
申请(专利权)人：艾文蒂斯巴斯德公司，梅里亚有限公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]