WRKY转录因子家族广泛存在于植物中。根据WRKY结构域的数量及锌指结构的特征，可以分为三类亚族(I、II、III)。本发明专利技术从感染番茄黄化曲叶病毒的番茄品种中分析鉴定到一个WRKY转录因子基因Soly WRKY41。该转录因子有1个WRKY结构域及C2HC的锌指结构，属于WRKY III类亚族成员。亚细胞定位分析表明SolyWRKY41转录因子属于核蛋白。病毒诱导基因沉默结果表明，SolyWRKY41基因负调控番茄黄化曲叶病毒。SolyWRKY41转录因子的功能研究丰富了番茄响应番茄黄化曲叶病毒的分子机制，并可用于番茄抗病育种中。
【技术实现步骤摘要】
一种响应番茄黄化曲叶病毒的SolyWRKY41基因的功能分析及应用
本专利技术属于植物基因工程领域，涉及植物的一个WRKYIII类转录因子的应用。本专利技术从番茄中鉴定到一个响应番茄黄化曲叶病毒的WRKYIII类转录因子基因SolyWRKY41，该基因有助于进行番茄响应番茄黄化曲叶病毒的抗性机制研究。
技术介绍
番茄(SolanumlycopersicumL.)属于茄科(Solanaceae)，番茄属(Solanum)，富含糖、食物纤维、矿物质、氨基酸及维生素等营养物质，在平衡人民饮食方面发挥着重要的作用。番茄不仅能降血脂降压，抗真菌，消炎，还能预防胃癌，特别是番茄红素具有抗氧化的功效，在化妆品及制药方面应用广泛。近年来，番茄栽培面积不断增加，对农民增收起着重要的作用，成为世界范围内广泛种植的主要蔬菜之一。番茄黄化曲叶病毒(tomatoyellowleafcurlyvirus，TYLCV)是一类由烟粉虱进行传播的植物病毒，属于双生病毒科，菜豆金色花叶病毒属。TYLCV能够危害南瓜、烟草、番茄等多达20种不同的植物。感染2周后，感病症状开始出现，主要表现为叶片逐渐黄化卷曲，新生叶片变小，皱缩，植株矮化；后期植株生长变缓甚至停滞，花朵枯萎。早期发病会严重影响植株的产量，后期发病主要会影响植株花及果实，使产量降低，品质下降，从而造成严重的经济损失(Glicketal.，PlantProtectSci2009，45：81，97)。近年来，由于烟粉虱的大量爆发及难以控制，TYLCV已广泛传播到世界各个地方，如地中海、日本、中国(Lefeuvreetal.，PLoSPathog2010，6：1-12)。作为一类重要的转录因子，WRKY转录因子参与了多种生物过程，包括种子发育及衰老、生物胁迫、非生物胁迫等(Rushtonetal.，TrendsinPlantSci2010，15：247-258；Eulgemetal.，CurrOpininPlantBiol2007，10：366-371；Guoetal.，PlantCellEnviron2004，27：521-549；Wuetal.，PlantCellRep2009，28：21-30)。WRKY转录因子家族可以分为I、II、III三个亚族，WRKYIII类转录因子可以参与不同的信号途径，从而提高植物的抗病性(Kaldeetal.，MolPlantMicrobeIn2003，16：295-305；Besseauetal.，JExpBot2012，63：2667-2679；Gongetal.，PlantCellEnviron2015，38：2248-2262)。
技术实现思路
本专利技术获得了一种番茄WRKYIII类转录因子基因SolyWRKY41，同时开展了该转录因子响应TYLCV的功能分析及应用研究。SolyWRKY41基因响应TYLCV的研究对于深入了解番茄响应TYLCV的过程有着较为重要的意义，为培育抗性番茄品种提供信息。附图说明图1.番茄SolyWRKY41的氨基酸序列与拟南芥WRKY家族的进化树分析，方框标注的为番茄SolyWRKY41转录因子。图2.番茄SolyWRKY41的亚细胞定位分析。图3.番茄SolyWRKY41基因在不同番茄品种中响应TYLCV的表达分析。图4.病毒诱导基因沉默验证番茄SolyWRKY41基因功能。具体实施方式：下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明，具体实验步骤如下：1.番茄转录因子基因SolyWRKY41基因的克隆以番茄‘浙杂301’叶片的cDNA为模板，设计一对特异引物(正向：5’-ATGGAGAAAGTTAAAAGTATGGA-3’，反向5’-TTAAATGAAGAATTCTTCAATGTC-3’)进行扩增。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min10s，共35个循环；72℃延伸10min。将目的条带进行回收、连接并转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。2.番茄转录因子SolyWRKY41的亚细胞定位通过核苷酸序列测定，获得了番茄转录因子基因SolyWRKY41的序列。将该序列根据设计的特异引物构入pA7载体(中国质粒载体菌种细胞基因保藏中心，北京)，正向：5’-CACCATCACCATCACGCCATGATGGAGAAAGTTAAAAGTATGGA-3’，反向：5’-CACTAGTACGTCGACCATGGCAATGAAGAATTCTTCAATGTC-3’。含有35S：：GFP(绿色荧光蛋白)的pA7空载作为对照，将构建好质粒导入烟草叶片细胞中，通过共聚焦显微成像系统LSM780(Zeiss，Oberkochen，Germany)观察该蛋白所在位置。3.实时定量PCR反应将生长至2叶状态的抗病番茄品种‘浙杂301’(浙江省农科院蔬菜所，杭州)及感病番茄品种‘金棚1号’(西安金鹏种苗有限公司，西安)幼苗分别置于带有TYLCV的烟粉虱防虫温室中。处理2、4、6、8、10d后取叶片样本并立即用液氮速冻，保存于-80℃冰箱中备用。根据SolyWRKY41基因序列设计表达检测引物，正向5’-GCAACACCAAACCATAACGCTGAA-3’，反向5’-AGGAATTTGAAATCGAAGTCGGAGT-3’。实时定量PCR采用iQTM5PCR仪及其系统(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)，按照操作说明进行。以番茄Tubulin基因的转录表达水平为内参，计算目的基因相对表达水平2-ΔΔCt(Chenetal.，PLoSOne2013，8：e80816；Yuaneta.，BMCBioinformatics2006，7：563-569)。4.病毒诱导基因沉默及TYLCV含量测定病毒诱导基因沉默实验所需载体为pTRV1和pTRV2(Liuetal.，PlantJ2002，30：415-429)。将扩增好的SolyWRKY41基因片段克隆到pTRV2载体上。同时将重组质粒转化农杆菌GV3101(北京天恩泽基因科技有限公司，北京)。以pTRV1+pTRV2为阴性对照，pTRV1+pTRV2-PDS(八氢番茄红素脱氢酶)为阳性对照，用菌液注射抗性番茄品种‘浙杂301’子叶。一周后取样提取RNA测定基因沉默水平。将沉默后的番茄幼苗转移到带毒烟粉虱防虫温室中进行感病处理，一周后取样并提取DNA。根据TYLCV基因组序列设计检测引物(NCBI登录号：AM282874.1)，正向：5’-AGTACCGCAACTGTGAAGAATGATT-3’，反向5’-CATACTTGGCTGCCTCCTGATGAT-3’。5.试验结果：1)将番茄SolyWRKY41基因编码的氨基酸序列与拟南芥WRKY氨基酸序列构建同源进化树，结果表明番茄SolyWRKY41和拟南芥WRKYIII类亚族转录因子归为一类，属于WRKY转录因子家族III类亚族成员(图1)。2)亚细胞定位结果表明，番茄SolyWRKY41属于核蛋白(图2)。3)荧光定量PCR结果显示番茄SolyWRKY41响应TYLCV。在抗病品种‘浙杂301’中，SolyWRKY41一直处于负调控的表达模式。感病品种‘金本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种番茄中获得的WRKY III类转录因子基因SolyWRKY41。
【技术特征摘要】
1.一种番茄中获得的WRKYIII类转录因子基因SolyWRKY41。2.权利要求1所述的番茄WRKYIII类转录因子基因SolyWRKY41的核苷酸序列。3.一种制备权利要求1所述的源于番茄的WRKYIII类转录因子基因SolyWRKY41的方法。4.权利要求1所述的番茄WRKYIII类转录因子基因SolyWRKY41的功能研究；1)通过亚细胞...
【专利技术属性】
技术研发人员：熊爱生，黄莹，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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