干扰素-β融合蛋白及用途制造技术

描述了一种包括糖基化干扰素－β（Ｘ）的氨基酸序列的具有氨基酸序列Ｘ－Ｙ－Ｚ的融合多肽或者其部分；Ｙ是任选的连接体部分；和Ｚ是包括除了糖基化干扰素－β以外的一种多肽的至少一部分的多肽。优选Ｘ是人干扰素－β－１ａ。也描述了干扰素－β－１ａ的突变体。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术背景现在多肽和蛋白质用于特殊疾病的全身治疗的用途在医学实践中是被普遍接受的。这些物质在治疗中所起的作用是如此重要，以至于很多研究热点都针对通过重组DNA技术的大量合成。这些多肽中很多是在激发它们的生物学作用中非常有潜力和特异性的内源分子。限制这些蛋白质类物质在它们趋向的应用中的用途的主要因素在于，当是亲本带来的时，它们在很短的时间内消失。这作为通过蛋白酶或者通过使用用于蛋白质消除的正常途径例如通过肾过滤的清除的代谢的结果而发生。与蛋白质给药的这些途径相关的问题在制药工业中是公知的，并且在努力中使用各种各样的方法来解决这些问题。是大多数临床工作焦点并且努力改进其给药和生物同化作用的肽家族是干扰素。对于多种临床疾病状态试验过干扰素。最好地确定了该家族的一个成员人干扰素-β在治疗多发性硬化中的用途。最近欧洲和美国许可了用于治疗该疾病的两种形式的重组干扰素-β。一种形式是干扰素-β-1a(已注册商标，以AVONEX出售，Biogen，Inc.，Cambridge，MA)，并且下文互换使用“干扰素-beta-1a”或“IFN-beta-1a”或“IFN-β-1a”或“干扰素-β-1a”。另一种形式是干扰素-β-1b(以AVONEX注册商标并出售，Berlex，Richmond CA)，下文称之为“干扰素-β-1b”。使用自然人基因序列在哺乳动物细胞中制备干扰素-β-1a并且是糖基化，而使用修饰的在氨基酸位置17处包含基因工程半胱氨酸-对-丝氨酸取代的人基因序列在大肠杆菌细菌中产生干扰素-β-1b，并且是非糖基化的。先前，我们中的几个人在功能测定中直接比较了干扰素-β-1a和干扰素-β-1b的相对体外效力并且证明干扰素-β-1a的比活比干扰素-β-1b的比活高大约10倍(Runkel等，1998，药物研究(Pharm.Res.)15641-649)。从设计用来鉴定这些活性差异的结构基础的研究，我们鉴定了糖基化作用，这是影响特异活性的产物之间的已知结构差异的唯一一种。碳水化合物的影响主要通过其对结构的稳定作用而证明。在热变性实验和SEC分析中证实了碳水化合物的稳定作用。聚集作用的增加和对热变性的提高的敏感性也与糖基化作用的缺失相关。使用导致去糖基化产物的过量沉积的PNG酶F从干扰素-β-1a酶去除碳水化合物。这些研究表明，尽管干扰素-β-1a和干扰素-β-1b之间序列有保守性，但是它们有截然不同的生物化学本质，因此对于干扰素-β-1b所知的许多不能适用于干扰素-β-1a，反之亦然。专利技术概述我们利用相对于非糖基化形式的糖基化干扰素-β的优点。特别地，我们开发出一种具有相对于干扰素-β-1b的提高的活性的干扰素-β-1a组合物，并且其一般也具有融合蛋白的有益性质，与不是融合蛋白的干扰素-β-1a形式相比没有活性的有效损失。因此，如果以一定方法进行修饰，使得产物(干扰素-β-1a融合蛋白)保留它们的全部或大部分生物活性，则可以获得下面的性质改变药物代谢动力学和药物动力学导致提高的半寿期和组织分布的改变(例如在脉管系统中停留更长时间的能力)。这样一种制剂是制药和医药学领域的一个实质性进步并且将对其中干扰素具有某些用途的各种疾病的治疗作出显著的贡献所述疾病是例如多发性硬化，纤维变性，和其它炎症或自身免疫疾病，癌症，肝炎和其它病毒疾病和特征在于新血管形成的疾病。特别地，在脉管系统中保持更长时间的能力使得要使用的干扰素-β-1a抑制血管生成并且有跨越血-脑屏障的可能。特别地，本专利技术涉及具有氨基酸序列X-Y-Z的分离的多肽，其中X是具有由干扰素-β的氨基酸序列组成的氨基酸序列或者其部分的多肽；Y是任选的连接基团部分；和Z是包括不是干扰素-β的多肽的至少一部分的多肽。任选的部分Y和必须的部分Z可以与干扰素-β(X)的N-或C-末端连接。优选地，X是人干扰素-β-1a。在优选的实施方案中，Z是免疫球蛋白的恒定区的至少一部分并且可以从选自IgM，IgG，IgD，IgA和IgE的类的免疫球蛋白衍生。如果是IgG类，则其选自IgG1，IgG2，IgG3和IgG4之一。人IgM和IgE的恒定区包含4个恒定区(CH1，(铰链)，CH2，CH3和CH4，其中人IgG，IgA和IgD的恒定区包含3个恒定区(CH1，(铰链)，CH2和CH3)。在本专利技术大多数优选的融合蛋白中，恒定区包含至少铰链，CH2和CH3区。在另一个实施方案中，Z部分是包含免疫球蛋白样区的多肽的至少一部分。这样的其它多肽的实例包括CD1，CD2，CD4和I类和II类主要组织相容性抗原成员。本专利技术另一个实施方案是具有由干扰素-β的氨基酸序列或者其部分组成的氨基末端区和包括不是干扰素-β的蛋白质的至少一部分的羧基末端区的融合蛋白。羧基部分优选是从选自IgM，IgG，IgD，IgA和IgE的类的免疫球蛋白衍生的免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。在最优选的融合蛋白中，恒定区至少包含铰链，CH2和CH3区。本专利技术的另一个实施方案是一种融合蛋白，其干扰素-β部分(如上式中的X)被诱变以提供相对于非突变形式的干扰素-β-1a具有选择性增强的抗病毒和/或抗增殖活性或者其它有利性质的突变蛋白。本专利技术的另一个实施方案是编码上述融合蛋白的分离的DNA。本专利技术还涉及包括编码上述融合蛋白的分离的DNA和一个表达调控序列的重组DNA，其中所述表达调控序列与所述DNA可操作地连接。本专利技术的范围也包括用本专利技术的重组DNA序列转化的宿主细胞。本专利技术进一步涉及制备重组多肽的方法，包括提供根据本专利技术的宿主细胞种群；在表达重组DNA编码的多肽的条件下培养所述细胞种群；和分离表达的多肽。本专利技术的另一方面是基本纯化形式的包括干扰素-β-1a和天然不相关的另外的多肽的干扰素-β-1a融合蛋白，该融合蛋白具有和没有该另外的多肽的干扰素-β-1a的抗病毒活性大约相同的抗病毒活性。本专利技术的另一方面是包括治疗有效量的干扰素-β-1a融合蛋白的药物组合物。本专利技术的另一方面是使用本专利技术的多肽抑制血管生成和新血管生成的方法。附图的简要说明附图说明图1组氨酸标记的干扰素-β融合(也称之为“hisIFN-β”或“His6-标记的”)的cDNA和推导的氨基酸序列。给出了该his干扰素-β-1a的全长DNA和蛋白质序列。裂解的VCAM-1信号序列离开组氨酸标记物(His6，位置4-9)的上游3个氨基末端残基(SerGlyGly)。肠激酶连接体序列(AspAspAspAspLys)通过间隔区(位置10-12，SerSerGly)与组氨酸标记物分开。天然干扰素-β-1a蛋白质序列跨越位置(Met18-Asn183)。图2干扰素-β-1a/Fc融合的cDNA和推导的氨基酸序列。给出了人干扰素-β-1a/鼠Fc的全长DNA和蛋白质序列。人干扰素-β-1a蛋白质序列跨越氨基酸残基1-166(DNA序列1-498)。肠激酶连接体序列跨越氨基酸残基167-171(DNA序列499-513)。鼠IgG2a重链蛋白质序列跨越残基172-399(DNA序列514-437)。图3丙氨酸取代的干扰素-β突变体与由I型干扰素受体链的胞外区组成的二聚体融合蛋白的结合，IFNAR2/Fc。如实施例1所述(D小节)测定了丙氨酸取代的IFN突变体(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有氨基酸序列Ｘ－Ｙ－Ｚ的分离的多肽，其中Ｘ是具有包括糖基化干扰素－β的氨基酸序列的氨基酸序列，或者其部分的多肽；Ｙ是任选的连接体部分；和Ｚ是包括除了糖基化干扰素－β之外的多肽的至少一部分的多肽。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：A惠蒂，L朗克尔，M布里克梅尔，P霍克曼，
申请(专利权)人：拜奥根IDEC马萨诸塞公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]