定向肝细胞的聚乙二醇接枝的聚-L-赖氨酸的聚合基因载体制造技术

本发明专利技术公开了一种聚合的定向基因送递载体的化合物，所述的化合物由聚乙二醇（ＰＥＧ）接枝的聚（Ｌ－赖氨酸）（ＰＬＬ）和定向部分（ＴＭ）组成，其中ＰＬＬ的至少一个游离的氨基官能团被所说的ＰＥＧ取代，ＰＬＬ的至少一个游离的氨基官能团被ＴＭ取代，并且接枝的ＰＬＬ含有至少５０％未取代的游离氨基官能团。ＴＭ优选为能够特异地定向于肝癌细胞或肝细胞的乳糖或半乳糖。采用核磁共振波谱法鉴定了具有不同ＴＭ－ＰＥＧ取代比例的新合成的载体。本发明专利技术新聚合的基因载体能够与核酸形成稳定且可溶的复合体，继而能够有效地转化细胞。与ＰＬＬ相连的ＰＥＧ为基因／载体复合体提供了更好的溶解性并且在不具有相当的细胞毒性的情况下改善了转染率。本发明专利技术公开了制备和使用ＴＭ－ＰＥＧ－ＰＬＬ作为聚合基因载体来有效地转染细胞的方法。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
与有关申请的交叉参考本申请要求1998年5月20日提交的美国临时申请60/086,072的优先权。
技术介绍
本专利技术涉及基因治疗。更具体地讲，本专利技术涉及一种聚乙二醇接枝的聚-L-赖氨酸和肝细胞定向分子-聚乙二醇接枝的聚-L-赖氨酸的组合物，该组合物用于基因送递到肝细胞中。二十五年前，Friedmann指出了人类基因治疗的前景(T.Friedmann与R.Roblin(1972)“人类遗传疾病的基因治疗？”175《科学》949-955(1972))。从此，基因治疗已经代表着治疗人类疾病和给药的一种新的方式。现有研究暗含的侧重点在于确定基因转移步骤的安全性，并且通常将功效作为第二个目标。基因转移主要的技术障碍在于缺乏理想的基因送递系统。如果将基因以足够的数量并且在没有副作用的情况下送递到合适的特异性细胞中是可能的话，那么基因治疗将会是有效的。目前，非常少的器官或细胞可以被特异性地定向以便进行基因送递。现有许多用于将基因转移到细胞中的确定的方法，其中包括磷酸钙沉淀、电穿孔、粒子轰击、脂质体送递、病毒-载体送递以及受体介导的基因送递(MS Wadhwa，“具有低分子量的糖肽载体的定向基因送递”6《Bioconj.Chem.》283-291(1995))。尽管这些所有的方法都可以用于哺乳动物的培养细胞，但是在将基因在体内引入到靶细胞中存在着许多困难。采用逆转录病毒或腺病毒载体的转染方法克服了这些限制中的一些限制。特别是，逆转录病毒载体已被成功地用于将外源基因引入到活性分裂细胞的基因组中，从而获得了稳定的转化体(D.G.Miller等人“通过逆转录病毒载体的基因转移仅仅发生在感染阶段中进行活性复制的细胞中”10《分子细胞生物学》4239-4242(1990))。病毒载体系统通常涉及由插入到“辅助”细胞系中以产生转导感染剂的基因来互补缺损载体。但是，众所周知宿主对腺病毒的免疫应答限制了其用作转移促进剂以进行单一给药。为了应对这种限制，已经采用流感病毒血凝素的融合肽来代替腺病毒作为红细胞浆质(endosomal)溶解剂，但是获得了有限的成功(S.Gottschalk等人“有效地进行基因转移和在哺乳动物细胞中表达的新的DNA-肽复合体”3《基因治疗》448-457(1996))。但是，尽管其在体外转染的效率很高，但是该方法中将基因插入到宿主细胞的基因组中取决于病毒感染的途径。本申请中用于人类基因治疗的病毒感染途径的应用给内源病毒重组、致癌作用以及炎症或免疫反应带来了严重的关注(G Ross等人“美国的基因治疗五年状况报告”7《人类基因治疗》1781-1790(1996))。由于这些忧虑，用于人类基因治疗的病毒载体的使用已经受到了极大的限制。另一方面，作为另一种替代的途径广泛地研究了非病毒基因送递系统，比如阳离子脂质体或合成的基因载体，例如聚-L-赖氨酸(PLL)(M.A.Wolfert等人，“由DNA与合成的嵌段共聚物自组装形成的基因治疗载体的特性描述”7《人类基因治疗》2123-2133(1996)；AV Kabanov&VA Kabanov“用于将遗传材料送递到细胞中的具有聚阳离子的DNA复合体”6《Bioconj.Chem.》7-20(1995))。包括其相对的安全性和低的生产成本在内，采用基于非病毒的基因治疗具有许多的好处。基于质粒的途径的主要限制为采用非病毒途径在基因向若干重要身体目标(即肝和肺)送递的效率和体内基因表达水平两方面都要比采用病毒载体的低。受体介导的基因送递具有其优势和限制(J.C.Perales等人“通过脱唾液酸糖蛋白受体能够定向基因go肝细胞的DNA复合体的生物化学与功能的特性描述”272《生物化学杂志》7398-7407(1997))。其在基因治疗中使用的优势如下。首先，可以针对特异的靶受体设计和定做基因送递载体。第二，不必将DNA整合到进行表达的宿主细胞的基因组中。第三，送递系统在理论上并不受转基因大小的限制。最后，该技术并不涉及使用潜在的感染试剂。在将该技术常规地用于人类的基因治疗之前，还存在着必须克服的不利之处。例如，该转基因并没有被整合到宿主细胞的染色体中，或者其表达是瞬时的。因此，最有可能的是必须使病人接受多次注射感兴趣的基因。DNA-配体复合体难于制备，并且直到最近有关其结构-功能之间的关系还所知甚少。而且，对参与转基因向细胞中的转移及其随后表达的生物过程仅仅有着不完整的了解。近来，已经详细地回顾了用于基因治疗的该系统的上述以及其它的特征(J.C.Perales等人对采用合成DNA-配体复合体的受体介导的基因转移的评价”226《欧洲生物化学杂志》255-266(1994))。在20世纪70年代的中期，据表明PLL使得与DNA一起凝聚(condensate)(U.K.Laemmli“由聚环氧乙烷和聚赖氨酸引发的DNA凝聚物的特性描述”72《美国国家科学院学报》4288-4292(1975))。从此，已将用各种物质修饰的PLL用作基因载体(M.S.Wadhwa等人“具有低分子量的糖肽载体的定向基因送递”6《Bioconj.Chem.》283-291(1995)；A.Maruyama等人(1997)“具有聚(L-赖氨酸)接枝物多糖共聚物和聚(D，L-乳酸)的纳米颗粒(nanoparticle)DNA载体”8《Bioconj.Chem.》735-742；G.Y.Wu与C.H.Wu“在体外定向基因送递至Hep G2肝癌细胞中的证据”27《生物化学》887-892(1988)；P.Midoux等人“由乳糖基化的聚-L-赖氨酸介导的向肝癌细胞中的特异性基因转移”21《核酸研究》871-878(1993)；P.Erbacher等人《糖基化聚赖氨酸/DNA复合体与糖基化聚赖氨酸的大小和糖取代水平以及与质粒的大小有关的基因转移效率》6《Bioconj.Chem.》401-410(1995))。PLL本身可以用作DNA的凝聚剂(condensate)(U.K.Laemmli“由聚环氧乙烷和聚赖氨酸引发的DNA凝聚物的特性描述”72《美国国家科学院学报》4288-4292(1975))。但是，单独使用PLL作为基因送递载体具有若干不利之处。首先，由于PLL除了在电荷中和中使用的氨基以外没有官能团，因此其转染率是非常低的。而且，由于DNA磷酸盐骨架带有负电荷，因此DNA电荷中和程度的增加通常导致广泛的凝聚以及呈不溶的紧密结构的DNA相的分离(J.C.Perales等人“通过脱唾液酸糖蛋白受体能够定向基因go肝细胞的DNA复合体的生物化学与功能的特性描述”272《生物化学杂志》7398-7407(1997)；D.E.Olins等人“模型核蛋白复合体有关阳离子型同聚多肽与DNA的相互作用的研究”24《分子生物学杂志》157-176(1967)；J.T.Shapiro等人“脱氧核糖核酸-聚赖氨酸复合体。结构与核苷酸特异性”8《生物化学》3219-3232(1969))。鉴于前述内容，应当理解的是提供一种基因治疗的定向组合物和一种采用所述组合物的方法在本领域中将会产生显著的进步。专利技术概述本专利技术的一个目的在于提供一种有效地介导DNA送递到靶细胞中的组合物(composition)。本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于聚合的基因载体的化合物，由聚乙二醇（ＰＥＧ）接枝的聚（Ｌ－赖氨酸）（ＰＬＬ）和定向部分（ＴＭ）组成，其中所说ＰＬＬ的至少一个游离的氨基官能团被所说的ＰＥＧ取代，所说ＰＬＬ的至少一个游离的氨基官能团被所说的ＴＭ取代，并且所述接枝的ＰＬＬ含有至少５０％未取代的游离氨基官能团。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：JS帕克，YH乔，F刘，
申请(专利权)人：表达遗传学公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]