DNA甲基化抑制剂在制备抗J亚群禽白血病病毒增殖药物中的应用制造技术

本发明专利技术涉及抗病毒研究领域，提供了DNA甲基化抑制剂在制备抗J亚群禽白血病病毒增殖药物中的应用。本发明专利技术利用DNA甲基化抑制剂处理鸡胚成纤维细胞，显著抑制J亚群禽白血病病毒增殖。本研究发明专利技术提供了抵抗禽白血病病毒的新手段，对禽白血病的防控具有重要意义。

Application of DNA methylation inhibitors in the preparation of anti J subgroup avian leukemic virus proliferation drugs

The present invention relates to the field of antiviral research, and provides the application of DNA methylation inhibitors in the preparation of anti J subgroup avian leukemic virus proliferation drugs. The invention uses DNA methylation inhibitor to treat chicken embryo fibroblast cells and significantly inhibits the proliferation of J subgroup avian leukosis virus. This invention provides a new way to resist avian leukosis virus, which is of great significance for the prevention and control of avian leukosis.

【技术实现步骤摘要】
DNA甲基化抑制剂在制备抗J亚群禽白血病病毒增殖药物中的应用
本专利技术涉及抗病毒研究领域，具体涉及一种DNA甲基化抑制剂在制备抗J亚群禽白血病病毒增殖药物中的应用。
技术介绍
表观遗传学是指不涉及DNA序列本身的遗传现象。肿瘤中表观遗传异常是非常普遍的，这包括DNA甲基化、组蛋白修饰异常等。其中，DNA甲基化是研究得最普遍的表观遗传修饰。抑癌基因表观遗传沉默的发现，导致表观遗传药物引入临床治疗。目前，表观遗传药物5-氮-2-脱氧胞苷(5-Aza-2-deoxycytidine，AZA)及其类似物5-阿扎胞苷(5-Azacytidine)作为DNA甲基化抑制剂用于白血病的临床治疗以及一些实体肿瘤的临床治疗研究。对于DNA甲基化抑制剂的抑癌机制，首先是它能使抑癌基因去DNA甲基化，从而激活抑癌基因。2015年同期两篇《Cell》文章报道DNA甲基化抑制剂能诱导内源性反转录病毒的表达，从而激活天然免疫通路基因，提出了DNA甲基化抑制剂的新抗癌机制。这一最新机制引起了对DNA甲基化抑制剂在抗病毒应用中的极大兴趣。既然DNA甲基化抑制剂能激活天然免疫，那么其是否可以作为一种既能抗肿瘤又能抗病毒的表观遗传药物呢？然而，目前并未有关于DNA甲基化抑制剂作为抗病毒药物的先例。并且，DNA甲基化抑制剂是否可以抑制病毒增殖？抑制效果究竟如何？目前，尚不清楚。因此，进一步揭示表观遗传药物DNA甲基化抑制剂在抗病毒研究领域中的应用成为一个重要的科学问题。禽白血病病毒(Avianleukosisvirus，ALV)属于禽反转录病毒科C型肿瘤病毒，是第一个证明可诱发肿瘤的病毒，在病毒性肿瘤发病机制及防治研究中发挥着动物模型作用。在自然界以内源性(ALVE)和外源性(如ALVA、ALVB、ALVC、ALVD和ALVJ)两种形式存在。其中，J亚群禽白血病病毒的致病性与传染性均高于其他亚群且尚无预防禽白血病的疫苗，给全球养禽业带来了极大的经济损失。目前，国内鸡群中的禽白血病病毒感染及白血病仍将是一个长期的问题，并且短期内很难研制出真正有效的预防禽白血病的疫苗。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能抗J亚群禽白血病病毒增殖的药物及其应用。本专利技术公开了DNA甲基化抑制剂在制备抗J亚群禽白血病病毒增殖药物中的应用。可采用DNA甲基化抑制剂处理J亚群禽白血病病毒感染或未感染的细胞。所述的DNA甲基化抑制剂为5-氮杂-2-脱氧胞苷，英文名称为5-Aza-2'-deoxycytidine，缩写为5-Aza-dC，其使用浓度为5μM。本专利技术提供一种抗J亚群禽白血病病毒增殖的方法，该方法包括采用DNA甲基化抑制剂处理鸡胚成纤维细胞的步骤。(1)细胞培养。将鸡胚成纤维细胞接种至6孔或24孔细胞培养板。(2)病毒感染。感染J亚群禽白血病病毒。(3)药物处理。病毒感染后24小时，加入DNA甲基化抑制剂，处理浓度为5μM；同时，加入等量DMSO溶剂作为药物对照。(4)DNA甲基化抑制剂处理后96小时，检测病毒增殖情况。当采用DNA甲基化抑制剂处理鸡胚成纤维细胞时，需要连续处理96小时。本专利技术通过体外研究观察到表观遗传药物DNA甲基化抑制剂可以有效抑制J亚群禽白血病病毒增殖。本专利技术对DNA甲基化抑制剂在抗病毒天然免疫研究领域的应用具有重大意义。附图说明图1是DNA甲基化抑制剂抑制J亚群禽白血病病毒p27蛋白表达图。图2是DNA甲基化抑制剂抑制J亚群禽白血病病毒滴度图。图3是DNA甲基化抑制剂抑制J亚群禽白血病病毒mRNA表达图。图4是DNA甲基化抑制剂抑制J亚群禽白血病病毒囊膜糖蛋白表达图。图5是DNA甲基化抑制剂抑制J亚群禽白血病病毒增殖图。具体实施方式以下实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1本实施例1中，感染病毒24小时后进行DNA甲基化抑制剂处理，通过ELISA、TCID50、荧光定量PCR、Western-blot和共聚焦免疫荧光方法评估了DNA甲基化抑制剂抗J亚群禽白血病病毒增殖能力。具体包括如下步骤：(1)细胞培养。将鸡胚成纤维细胞接种至6孔或24孔细胞培养板。(2)病毒感染。感染J亚群禽白血病病毒(毒株JS09GY3，GenBankaccessionnumberGU982308)。(3)药物处理。病毒感染后24小时，加入DNA甲基化抑制剂，处理浓度为5μM；同时，加入等量DMSO溶剂作为药物对照。(4)DNA甲基化抑制剂处理后96小时，收集上清，使用IDEXX禽白血病抗原检测试剂盒检测J亚群禽白血病病毒p27蛋白表达水平。结果如图1所示，DNA甲基化抑制剂5-Aza-dC显著抑制了ALVJ(JS09GY3)病毒p27蛋白表达。(5)DNA甲基化抑制剂处理后96小时，收集细胞和上清，使用TCID50方法测定J亚群禽白血病病毒滴度。结果如图2所示，DNA甲基化抑制剂5-Aza-dC显著降低了ALVJ(JS09GY3)病毒滴度。(6)DNA甲基化抑制剂处理后96小时，收集细胞，使用荧光定量PCR方法测定J亚群禽白血病病毒滴度。结果如图3所示，DNA甲基化抑制剂5-Aza-dC显著抑制了ALVJ(JS09GY3)病毒mRNA表达。(7)DNA甲基化抑制剂处理后96小时，提取总蛋白，Western-blot测定J亚群禽白血病病毒Env蛋白表达。将DNA甲基化抑制剂和DMSO处理的细胞裂解液进行SDS-PAGE,然后按照Western-blot操作步骤转移到硝酸纤维素膜，5％脱脂乳封闭后分别加入ALVJ囊膜糖蛋白的特异性单抗JE9抗体和HRP标记的山羊抗兔IgG进行孵育，观察结果。结果如图4所示，DNA甲基化抑制剂5-Aza-dC显著抑制了ALVJ(JS09GY3)病毒囊膜糖蛋白表达。(8)DNA甲基化抑制剂处理后96小时，使用共聚焦免疫荧光测定J亚群禽白血病病毒Env蛋白表达。简要步骤如下：4％多聚甲醛室温固定20分钟，PBS洗涤三次，每次5分钟；0.5％TritonX-100室温通透15分钟，PBS洗涤三次；2％BSA室温封闭30分钟，PBS洗涤三次；加入稀释至工作浓度的ALVJ囊膜糖蛋白的特异性单抗JE9，37℃孵育1小时，PBS洗涤三次；避光条件下加入稀释至工作浓度AlexaFluor488标记的山羊抗鼠IgG，37℃孵育40分钟，PBS洗涤三次；避光，DAPI染色液染色10分钟，PBS洗涤三次后封片处理。最后，使用LeicaSP8共聚焦显微镜进行观察拍照。结果如图5所示，DNA甲基化抑制剂5-Aza-dC显著抑制了ALVJ(JS09GY3)病毒增殖。本文档来自技高网...

【技术保护点】
DNA甲基化抑制剂在制备抗J亚群禽白血病病毒增殖药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.DNA甲基化抑制剂在制备抗J亚群禽白血病病毒增殖药物中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的DNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔恒宓，胡序明，陈世豪，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32