一种植酸酶基因及其克隆制造技术

本发明专利技术是一种植酸酶基因及其克隆，属于生物工程领域。本发明专利技术提供了一种来自于无花果曲霉（Ａ．ｆｉｃｕｕｍ）Ａｓ３．３２４编码ＰＨＹＡ型植酸酶的基因ｐｈｙＡⅠ，提供了ｐｈｙＡⅠ序列及其相应的氨基酸序列。提供了含有ｐｈｙＡⅠ的克隆载体ｐＵＣ１９／ｐｈｙＡⅠ和含有这种载体的Ｅ．ｃｏｌｉ细胞ＪＭ１０９／ｐＵＣ１９／ｐｈｙＡⅠ。本发明专利技术可用于构建植酸酶基因工程菌，提高微生物发酵产植酸酶的水平；还可用于农作物的基因转化，达到改善农作物品质的目的。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是一种植酸酶基因及其克隆，属于生物工程领域，特别涉及到无花果曲霉(A.ficuum)As3.324编码PYHA型植酸酶的基因及其克隆。植物中总磷的60％-90％以植酸的形式存在，这些磷不能被人和单胃动物所利用，食物尤其是集约化畜牧业的饲料中需添加矿物质磷，这一方面是矿物质原料的浪费，另一方面未消化的植酸排出体外，造成土质和水质环境的磷污染。植酸还有强烈的抗营养作用，它能螯合矿物质和蛋白质，影响人及动物对微量矿物质元素的吸收，抑制蛋白质尤其是消化酶系的生物学活性。植酸酶能催化水解植酸，释放游离肌醇、磷酸及多磷酸中间产物。利用植酸酶对植酸的水解作用，能够提高人或单胃动物对植物性食品或饲料中磷的利用率，解除植酸的抗营养作用，而且有利于环境保护。植酸酶广泛存在于微生物特别是真菌中，但目前只有少数来自于不同微生物的植酸酶基因被测序克隆。无花果曲霉(A.ficuum)As3.324的植酸酶属于PHYA型植酸酶，其酶学性质特别是在pH2.5和pH5.5处有两个酶活性高峰，适合于在人或动物胃肠中作用。目前，野生型微生物包括无花果曲霉As3.324的产植酸酶水平较低，以至于微生物发酵生产的植酸酶成本很高。本专利技术提供了无花果曲霉(A.ficuum)As3.324编码PHYA型植酸酶的基因phyAI序列及其相应的氨基酸序列。提供了含有As3.324植酸酶基因phyAI的克隆载体pUC19/phyA I和含有这种载体的大肠杆菌(E.coli)细胞JM109/pUC19/phyA I。利用本专利技术成果，可以构建植酸酶基因工程菌，提高微生物发酵产植酸酶的水平，降低植酸酶生产成本；还可用于植物尤其是经济农作物的基因转化，达到改善农作物品质的目的。本专利技术以无花果曲霉(A.ficuum)NRRL3135的植酸酶基因phyA核苷酸序列作参考，设计并合成两条寡核苷酸引物，提取As3.324基因组DNA为模版，PCR方法合成phyAI，并对PCR产物测定核苷酸序列。将phyAI和克隆载体PUCl9分别用限制性内切酶切割，形成互补的粘性末端，T4DNA连接酶连接，形成phyAI克隆载体pUC19/phyAI。热激法将这个克隆载体导入感受态E.coli JM109，成为含有pUC19/phyAI的大肠杆菌细胞JM109/PUC19/phyAI。无花果曲霉(A.ficuum)As3.324植酸酶基因phyAI核苷酸序列如下 其中 为转录起始密码， 为转录终止密码， 框线中序列为植酸酶活性位点编码序列，小写字母表示内含子序列。根据以上核苷酸序列，推测A.ficuum As3.324植酸酶蛋白的氨基酸序列如下 441 LGRCT RDSFV KGLSF ARSGG461 DWAEC FAphyA I的结构基因全长1515bp，+46-+156的111个核苷酸为内含子序列，其中含有真菌内含子的特征保守序列，Donor序列GTATGC，Lariat序列GCTGAC，Acceptor序列CAG。phyA I共编码467个氨基酸，N端的19个氨基酸为信号肽，信号肽的切割位点在第19位氨基酸Gly之后，在phyA I编码的氨基酸序列中存在10个潜在的N-糖基化位点，81-88位氨基酸为植酸酶的活性位点保守序列RHGARYPT。克隆载体pUC19/phyA I中含有phyA I全序列。受体大肠杆菌细胞JM109/pUC19/phyA I中含有克隆载体pUC19/phyA I。phyA I是首次被提取、测序和克隆的无花果曲霉(A.ficuum) As3.324的植酸酶基因。因其所编码的植酸酶适合作用于在人和单胃动物的胃肠中作用，所以该基因的克隆可用于构建表达植酸酶的基因工程菌，提高微生物发酵产植酸酶的水平，降低植酸酶生产成本；还可用于植物尤其是经济农作物的基因转化，达到改善农作物品质的目的。以下是本专利技术的最佳实施例实施例1Aficuum As3.324植酸酶基因phyA I的PCR扩增和测序用马铃薯培养基培养A.ficuum As3.324，30℃振荡培养24小时后收集菌体，液氮研磨菌体，以氯化苄为提取液提取As3.324基因组DNA。以A.ficuumNRRL3135的植酸酶基因phyA核苷酸序列作参考，设计并合成两条PCR引物如下F15’-AGGTGGGATGAAGGGGTTAT-3’R15’-CAGCGGCCGCCTAAGCAAAACTCTCCGCCC-3’PCR反应条件如下Template1μlLA Taq 0.5μldNTP8μl2×GCIbuffer25μlF1(20pmol/μl) 1μlR1(20pmol/μl) 1μlddH2O up to 50μl94℃ 1′ 4℃PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，用回收试剂盒D301CA(TaKaRa公司产品)回收约1.5Kb的DNA片断，对该DNA片断用Sanger链终止法测定其核苷酸序列，为无花果曲霉(A.ficuum)As3.324的植酸酶基因phyA I。实施例2phyA I与克隆载体PUC19的重组phyA I和克隆载体PUC19分别用EcoR I/Pst双酶切。酶切条件如下Eppendorf AEppendorf BddH2O 9μl ddH2O 13μl10×H 2μl 10×H 2μl0.1％BSA 2μl 0.1％BSA2μlPCR片段(1μg/μl) 5μl 质粒PUC19(1μg/μl) 1μlEcoR I 1μl EcoR I 1μlPst I 1μl Pst I 1μl37℃酶切3小时，电泳后分别回收两个目的片段，用T4DNA连接酶连接。连接条件如下ddH2O6μlPCR片段(0.1μg/μl) 1μlPUC19(0.05μg/μl)1μl10×T4DNA连接酶Buffer 1μlT4DNA连接酶(1U/μl) 1μl16℃连接1小时，电泳检测连接产物，回收其中约4.2Kb片段为含有phyA I的克隆载体pUC19/phyA I，用于转化大肠杆菌。实施例3克隆载体pUC19/phyA I转化大肠杆菌JM109加入60μl解冻的感受态E.coli JM109和10μl连接液至Eppendorf中，冰上30秒，42℃50秒，冰上2分钟，加入37℃的LB培养基930μl，37℃震荡培养1小时。菌液与4μlIPTG及40μlX-gal混合后涂含有50mg/Ap的LB平板上，37℃培养过夜。挑选白色菌落做PCR检测，琼脂糖凝胶电泳中呈现1.5Kb特异带者为阳性转化菌落，为含有pUC19/phyA I的大肠杆菌JM109/pUC19/phyA I。从JM109/pUC19/phyA I中提取质粒，以PUC19的测序通用引物测定外源插入序列phyA I的核苷酸序列，与实施例1所述PCR测序结果一致。权利要求1.一种植酸酶基因，phyAI，其特征在于它是无花果曲霉(A.ficuum)As.3324编码PHYA型植酸酶的基因。2.根据权利要求1所述植酸酶基因phyAI的核苷酸序列 466 TACAACTACA GCCTGGGCGC GGATGACCTG496 ACTCCCTTCG GAGAGCAGGA GCTGG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种植酸酶基因ｐｈｙＡⅠ，其特征在于它是无花果曲霉（Ａ．ｆｉｃｕｕｍ）Ａｓ．３３２４编码ＰＨＹＡ型植酸酶的基因。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张苓花，安利佳，袁晓东，包永明，王运吉，
申请(专利权)人：大连理工大学，大连轻工业学院，
类型：发明
国别省市：91[中国|大连]