诱导细胞死亡的方法技术

本发明专利技术涉及诱导细胞死亡的方法。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，更确切地说，但不仅仅局限于使用从乳头状瘤病毒中得到的E2和/或E7蛋白杀死细胞的方法。乳头状瘤病毒(PV)，属于乳多空病毒家族的病毒，是具有双链环状DNA的DNA病毒，该双链环状DNA有许多基因包括E2、E6和E7基因。它们感染上皮细胞并通常诱导良性高增殖病变的形成。无数男人和女人患有由一种人体乳头状瘤病毒(HPV)所引起的生殖器道感染，该导致外阴部疣的病毒至少有95种类型。然而，一些类型的乳头状瘤病毒与更严重的情况如癌有关。例如，HPV16型和18型与女性的子宫颈癌(zur Hausen，H(1991)Virology，184，9-13)有关，牛乳头状瘤病毒(BPV)2型和4型分别与牛的膀胱癌和上消化道癌有关(Campo，M.S.，等(1992)Cancer Res.52，6898-6904，CampoM.S.，等(1994)Carcinogenesis，15，1597-1601)。人体子宫颈癌细胞表达病毒E6和E7癌基因，这些基因的产物增加了细胞的增殖并促进了细胞的无限增殖化(Crook，T.，andVousden，K.H.(1996)Papillomavirus ReviewsCurrent Research onPapillomaviruses(Lacey，C.，ed)55-60页，Leeds University Press，Leeds)。人体乳头状瘤病毒E2基因或缺少人体乳头状瘤病毒E2基因都被认为与感染PV的细胞一起在子宫颈癌的形成中起着主要作用。大多数子宫颈癌包含经染色体整合的HPV基因组的拷贝，其中病毒E2基因由于病毒环状DNA的开环而导致分离(Baker，C.C.，等(1987)J.Virol.，61，962-971)。进一步，E2基因的突变增加了HPV16的无限增殖能力(Romanczuk，H.，and Howley，P.M.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89，3159-3163)。乳头状瘤病毒E2基因编码序列特异性DNA结合蛋白，该序列特异性DNA结合蛋白调控病毒基因表达，在病毒DNA复制中也需要该蛋白(Thierry，F.(1996)Papillomavims ReviewsCurrent Researchon Papillomaviruses(Lacey，C.，ed)21-29页，Leeds UniversityPress，Leeds)。E2蛋白与在病毒长调控区(LCR)内发现的一个反向重复序列的多个拷贝相结合为二聚体。依靠特定的PV病毒和被研究的特定E2蛋白，E2与这些位点的结合能激活或阻遏E6和E7癌基因的转录。例如，HPV16 E2蛋白激活从位于HPV16 LCR的3’末端的P97启动子的转录，它引起E6和E7癌基因的转录增加，而在几乎相同的条件下，BPV1 E2蛋白阻遏P97启动子的活性(Boulvard，V.等(1994)EMBO J.，13，5451-5459，Kovelman，R等(1996)Virol，70，7549-7560)。E2二聚体的每个亚单位包含两个被柔性绞链区分开的结构域每个亚单位的N末端结构域介导病毒转录的调控，而C末端结构域介导DNA的结合(Giri，I.，和Yaniv，M(1998)EMBOJ.，7，2823-2329)。在BPV中，缺少N末端转录结构域的截短的E2蛋白也被表达。这些截短的E2蛋白(E2-TR)能阻遏病毒转录，并也能与具有全长的E2形成转录失活的异源二聚体(Barsoum，J.等(1992)J.Virol.，66，3941-3945)。从HPV16、HPV18和BPV1得到的E2蛋白都对子宫颈癌细胞系的增殖和生存具有显著作用。我们已说明了HPV16 E2蛋白在经修饰的SiHa细胞中的表达。SiHa细胞是一个包含E2基因片段的单拷贝的HPV16转化细胞系。我们在重金属诱导的金属硫蛋白启动子的控制下，制造了表达HPV16 E2蛋白的SiHa-E2稳定细胞系。使用重金属诱导E2在这些细胞中的表达导致了经由细胞凋亡的细胞死亡(Sanchez-Perez，A.等(1997)J.Gen.Virol.，78，3009-3018)。E2诱导的细胞死亡表现出细胞凋亡的几个典型特征，包括细胞膜出现气泡、染色质凝聚和出现带有亚-G0 DNA成分的细胞片段。类似地，HPV18 E2蛋白诱导HeLa细胞的细胞凋亡，HeLa细胞也是一个包含E2基因片段的拷贝的HPV18转化细胞系(Desaintes，C.，等，(1997)EMBO J.16.504-514)。BPV1 E2蛋白在SiHa或HeLa细胞中的表达表明它是，至少部分是，通过阻断细胞从G1期到S期的碱基转换来阻遏增殖(Hwang，E.S.，等(1993)J.Virol.，67，3720-3729，Dowhanick，J.J.，等(1995)J.Virol.，69，7791-7799，Hwang，E.S.，等(1996)Oncogene，12，795-803)。由于在这些实验中使用的增殖测定，几天后培养物上得到了菌落形成，BPV1 E2可能也在这些细胞系中诱导细胞凋亡。还有证据表明E2蛋白可能对非HPV转化细胞有影响。HPV31 E2蛋白使用重组腺病毒在HPV阴性正常人体包皮角质形成细胞(NHKcells)中的表达，导致在细胞周期的S期抑制，及带有亚-G0 DNA成分的细胞的出现是一个细胞凋亡的典型特征(Frattini，M.G.，等(1997)EMBO J.，16，318-331)。然而，BPV1 E2对C33a细胞或SAOS细胞的增殖没有作用，C33a细胞是一种HPV阴性子宫颈癌细胞系，SAOS细胞是一种HPV阴性骨肉瘤细胞系(Dowhanick，J.J.等(1995)J.Virol.69.7791-7799)。进一步，HPV18 E2蛋白对C33a细胞、SAOS细胞或HACat细胞的细胞凋亡的数量没有作用，HACat细胞是一种自动无限增殖的HPV阴性人体角质形成细胞系(Desaintes，C.，等(1997)EMBO J.，16.504-514)。目前，没有模型能满意地解释E2蛋白对细胞增殖的影响。附图说明图1是从HPV16 E2蛋白到诱导细胞凋亡的几个可能途径的示意图。底线代表整合HPV基因组，弯箭头表示P97启动子。E2蛋白调控HPV16E6和E7基因(开放框)的转录。E6与p53结合并减少了细胞内p53的半衰期。E7与Rb结合并导致E2F的释放。p53和E2F都能产生细胞凋亡。注意到即使不依赖于E2对E6和E7转录的影响，E2也能诱导细胞凋亡。在包含整合的HPV DNA的细胞系中，已表明BPV1E2和HPV18 E2能阻遏HPV18 E6和E7癌基因的转录(Hwang，E.S.，等(1993)J.Virol.，67，3720-3729，Desaintes，C.，等(1997)EMBOJ.，16.504-514)。肿瘤抑制蛋白p53被很好地表征。有许多p53的突变体以及p53相关基因，例如p73和p63(White，E.和Prives.C.，Nature，399.61999)。E6蛋白与肿瘤抑制蛋白p53相结合，这种作用导本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诱导ＰＶ阴性ｐ５３野生型、ｐ５３突变型或ｐ５３相关基因阳性细胞的细胞凋亡的方法，包括用ＰＶ Ｅ２和／或Ｅ７蛋白或它们的功能部分或衍生物与这些细胞接触，或向这些细胞提供一个编码ＰＶ Ｅ２和／或Ｅ７蛋白或它们的功能部分或衍生物的ＤＮＡ序列。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：凯文利昂加斯汤，彼得莱斯莱斯特恩，安东尼拉塞尔克拉克，
申请(专利权)人：布里斯托尔大学，
类型：发明
国别省市：GB[英国]