酶的电子供体系统及其在底物生物化学转化中的用途技术方案

本发明专利技术涉及一种新的，具有氧化还原特性的酶的电子供体系统，及其在酶－催化的氧化反应，例如，特别是，ω－羟基化脂肪酸生产中的用途。本发明专利技术还涉及一种改进的，脂肪酸单加氧酶的检测方法，生物反应器，和试剂盒，其中可有利地使用该电子供体系统。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种新的，具有氧化还原特性的酶的电子供体系统，及其在酶-催化的氧化反应如，特别是，ω-羟基化脂肪酸制备中的用途。此外，本专利技术还涉及一种改进的，脂肪酸单加氧酶检测方法，生物反应器和试验试剂盒，其中可有利地使用该电子供体系统。具有氧化还原特性的酶，如单加氧酶在无细胞反应系统中的生物工程用途常存在这样一个问题，即提供必需的氧化还原等价物的天然辅因子(如，NADH或NADPH)的成本过高。其也可用于含细胞色素P450的单加氧酶的生物工程用途。所有的P450酶均具有将氧原子转移到非活化脂肪族或芳香族X-H(X＝-C，-N，-S)键的共同功能。此外，P450酶还能够环氧化-C＝C-双键。大多数P450酶均需要这些氧合反应辅因子，如NADPH或NADH作为电子源。根据此电子转移系统(还原酶系统)的实施可将P450系统分成四类。I类P450酶含有作为还原酶的一个FAD结构域和另一个Fe-S蛋白(通常是线粒体和细菌P450酶)，II类P450酶具有FAD/FMN还原酶(通常是ER P450酶)，III类P450酶不需要其它的还原等价物；它们可转化已经含氧的过氧合底物。只有IV类P450酶可在没有转化系统的情况下，直接从NADH获得电子。由P450系统化合物催化的单加氧酶功能的多样性通常仅通过化学方法获得，所述化学方法难以提供巨大的生物工程，药理学及毒理学的潜力。体外使用这些潜力的一个重要前提是适当的表达，纯化，且特别是活性检测系统的发展，其中的活性检测系统可描述P450系统的特性，且可找到具有“改进”特性的酶变体。使用这些P450单加氧酶，特别是I类和II类酶的另一个重要前提是在成本合理的情况下，电子供体系统的有效性。Deffner等，Ann.N.Y.Acad.Sci(1987)501，171描述了NADPH辅因子的再循环系统。然而，在制备规模使用时，其提出一个成本问题，并使在酶-膜反应器中进行的反应复杂化。因此，已经寻找到可供选择的电子供体。其中一个有希望的途径是P450酶的电化学还原。Estabrook等(Methods Enzymol.(1996)272，44)可使用Co(III)sepulchrate介质系统和Pt电极测定六种不同P450酶的转化。然而，其活性比还原等价物NADPH约少8倍。代替所述介质，人们发现连二亚硫酸钠是一种直接还原P450酶的化合物(Fang等，Drug.Metab.Dispos.(1996)24(11)1282)。在P450 BM-3的情况下，与NADPH相比，其活性是经因子8150使用连二亚硫酸钠降低的；推测P450 BM-3可被连二亚硫酸钠降低三倍，从而被大部分灭活。本专利技术的其中一个目的首先是在成本合理的条件下，提供一种有效的，可供选择的酶电子供体系统，其中的酶具有氧化还原特性。人们特别期望此系统可用于生物化学转化，含P450细胞色素的酶参予这些转化。另外，还提供一种改进的，P450酶的检测方法。本专利技术的另一个目的是提供一种改进的生物工程方法，其可将氧酶促转移到有机分子中，且，特别可使具有极性基团的烃基化合物，特别是脂肪酸末端或近末端羟基化。我们已经发现这些目的是通过提供一种电子供体系统而获得的，所述电子供体系统用于将电子转移到具有氧化还原特性的酶中，其中该系统包含一种无机的非-电极-束缚电子源和一种能够将电子从电子源转移到酶的介质。在系统组成这一点上，它可能是单独地或以混合物的形式，特别是，载体-束缚或，优选地，非-载体-束缚形式存在的。本专利技术“非-电极-束缚的电子源”能够在一对电极间没有施加外部电压的情况下，将电子传递到介质。特别是，这需要经由化学氧化还原反应，通过电子源还原介质。本专利技术提供的电子供体系统可特别用于含细胞色素P450的酶，如包含在单加氧酶(E.C.1.14.-.-)大家族中的酶。这里提到的非限制实施例是细胞色素P450单加氧酶BM-3，其可从巨大芽胞杆菌中分离出来。在电子供体系统的优选实施方案中，后者包含一种具有约小于-0.4V标准电压的介质(例如，在标准条件下，相对于甘汞电极测量，参见下面的Creasar等)。可用于本专利技术介质的非限制实施例是钴(III)sepulchrate，甲基紫罗碱(methylriologen)，中性红，核黄素，三醋酸钌，FMN和FAD，钴(III)sepulchrate是优选的。在标准条件下，钴(III)sepulchrate具有-0.54V的标准电位(参见，Creasar等(1977)，J.Am.Chem.Soc.，99，3181)。本专利技术的电子供体系统优选包含作为电子源的一种金属，其具有比介质还要低的标准电位。这里提到的电子源非限制实施例是金属锌。用于此目的的金属优选以反应形式存在，即，具有较大的表面积，如，以粉末形式存在。本专利技术优选的电子供体系统包含下列电子源和介质的组合-Zn/钴(III)sepulchrate或-Zn/中性红。本专利技术还涉及一种酶氧化方法，即，将氧转移到含碳氢化合物的氢供体分子(即，一种可氧化的化合物)上，其包含在有氧参与的反应条件下，在反应培养基中培养氢供体分子，其中该培养基包含氧-转移酶和上述的电子供体系统。用于本专利技术目的的“氧化反应”涉及广义上的酶催化氧化反应。特别是，该术语包括这种氧化反应，其是由来源于单加氧酶类(E.C.1.14.-.-)，特别是，细胞色素P450酶的酶催化的。这些氧化反应包括a)饱和或不饱和的，脂肪族或芳香族碳原子的碳氧化反应，例如，羟基化反应和环氧化反应；b)硫的氧化反应；c)氮的氧化反应；d)氧化的去烷基化反应；和e)氧化的去卤化反应。氢供体分子优选从下列通式化合物中选择R-X其中R是直链或支链的，优选直链的，具有8个或更多碳原子，如10-30个碳原子的烷基，且X是能够形成氢键，优选羧基，酰胺，腈，硫酸盐，磺基，胺或羟基的极性基团。上述方法的优选变体涉及末端或近末端(即，ω-1-ω-4位)羟基化脂肪酸的酶制备，其包含a)在有上述电子供体系统参与的情况下，使用细胞色素P450单加氧酶和氧转化可羟基化脂肪酸或可羟基化脂肪酸的衍生物；并b)分离羟基化的产物。本专利技术ω-可羟基化(即，末端或近末端可羟基化的)脂肪酸或其衍生物优选选自或来源于末端饱和的，具有8个或更多碳原子，例如，超过10个碳原子的支链或无支链脂肪酸，特别是C12-C30脂肪酸。本专利技术可羟基化脂肪酸的非限制实施例是辛酸，壬酸，十一酸，十二酸，十三酸，十四酸，十五酸，十六酸，十七酸，十八酸，十九酸，二十酸，二十二酸，二十四酸，二十六酸和三十酸。适当脂肪酸衍生物的实施例是具有短链，特别是C1-C4羧酸的C1-C4烷基酯，酰胺或酸酐。优选地，用于上述本专利技术方法中的酶是细胞色素P450单加氧酶，其选自-E.C.1.14.-.-类，特别是来源于CYP102 P450家族的细胞色素P450单加氧酶，或真核或原核的，特别是细菌起源的酶，优选野生型酶，其可从巨大芽孢杆菌(Bacillua megaterium)(DSM 32T)中分离；或-其突变体。优选的突变体来源于细胞色素P450单加氧酶BM-3，而该酶则来源于具有SEQ ID NO35所列氨基酸序列的巨大芽孢杆菌，其具有下列氨基酸序列区中的至少一个功能本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种将电子转移到具有氧化还原特性的酶的电子供体系统，其中该系统包含一种无机的非－电极－束缚电子源和一种介质，其可将电子从电子源转移到酶。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：B豪尔，RD施密德，U施瓦尼伯格，
申请(专利权)人：BASF公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]