一种NTx检测试纸、试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种NTx检测试纸条，包括层析膜和结合垫；结合垫上担载免疫标记的NTx抗体和免疫标记的第一抗体，层析膜上沿液体层析方向设有包被NTx蛋白的检测线和包被第二抗体的比色线。样品检测时，第二抗体特异性结合第一抗体后，比色线对应显示特定蛋白浓度的色度，检测线上NTx蛋白与样品中NTx蛋白竞争性结合免疫标记的NTx抗体，通过直观比较检测线与比色线显色的深浅，实现对NTx蛋白的半定量检测。本发明专利技术公开了NTx检测试纸条的制备方法，用于制备检测快速、灵敏、不依赖仪器的NTx蛋白半定量检测试纸条。本发明专利技术公开了NTx检测试剂盒，包括上述的NTx检测试纸条，能够为骨质疏松症的早期诊断、治疗提供有效信息。

A NTx test paper, kit and preparation method

The invention discloses a NTx detection strip, including chromatography membrane and binding pad; combined with the first antibody NTx antibody and immune marker pads supported immune markers of the chromatography membrane along the liquid chromatography is coated by detection of NTx protein and line second antibody coated color line. Sample testing, second antibody binding antibody, colorimetric lines corresponding to display color specific protein concentration, NTx protein competitive online NTx protein samples and detection antibody labeled with NTx, and the color line color line than the depth of detection through intuition and Realization of semi quantitative detection of NTx protein. The invention discloses a preparation method of the NTx test paper strip for preparing the NTx protein semi quantitative test paper strip which is fast, sensitive and independent of the instrument. The invention discloses a NTx detection kit, including the NTx test paper strip, which can provide effective information for the early diagnosis and treatment of osteoporosis.

【技术实现步骤摘要】
一种NTx检测试纸、试剂盒及其制备方法
本专利技术属于免疫化学检测
，具体涉及一种NTx检测试纸、试剂盒及其制备方法。
技术介绍
骨质疏松症(osteoporosis,OP)是以骨量减少，骨组织微细结构破坏导致骨脆性增加和骨折危险性增加为特征的一种系统性、全身性骨骼疾病。随着人口寿命的不断增长及老年人口不断增加，骨质疏松症的发病率已在世界常见多发病中跃居继心脑血管病、癌症之后的第七位，是继心血管疾病后第二大医疗问题。我国是骨质疏松症患者最多的国家，发病人数约l亿人，骨质疏松症成为影响老年人健康的一个主要问题，50岁以上的人群中大约有一半的女性和四分之一的男性患有骨质疏松症。当前对于骨质疏松症研究的重点是如何早期作出诊断，最终通过有效的干预，防止症状的出现和骨折的发生。人体的骨组织在不断进行着新陈代谢，骨形成、骨吸收和静止3个阶段构成了骨转换的过程，在骨转换过程中产生的一些代谢物，叫做骨转换生化标志物(biochemicalmarkersofboneturnover)，简称骨标志物(bonemarkers)。骨转换生化标志物反映了骨转换的总体速率，代表了全身骨骼的动态状况，许多非骨骼性疾病也会影响骨代谢而改变骨转换的速率，这些标志物已经成为诊断代谢性骨病、评估抗骨吸收和促骨形成药物疗效的重要指标。由于骨转换标志物检测具有无创、快速、灵敏的优点，对于其应用于骨质疏松症的早期发现、骨折危险性预测、骨转换类型判断、骨丢失速率判断，以及了解病情进展、选择干预措施和疗效监测等方面都有着重要的价值。骨标志物分为骨形成标志物和骨吸收标志物，骨形成标志物代表成骨细胞活动和骨形成时的骨代谢产物，骨吸收标志物代表破骨细胞活动和骨吸收时的代谢产物，特别是骨基质降解产物。其中骨形成的标志物有：血清碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OC)、骨源性碱性磷酸酶(BALP)、I型原胶原C-端前肽(PICP)、I型原胶原N-端前肽(CINP)；骨吸收的标志物有：空腹2小时尿钙/肌酐比值、血清抗酒石酸酸性磷酸酶(TPACP)、Ⅰ型胶原C末端肽(S-CTX)、尿吡啶啉(Pyr)、尿脱氧吡啶啉(D-Pyr)、尿Ⅰ型胶原交联C-末端肽(U-CTX)、尿Ⅰ型胶原交联氨基末端肽(U-NTx)。胶原又称胶原蛋白，是一种糖蛋白，在人体中主要分布于结缔组织。胶原共有4型，骨有机质中的胶原90％为I型胶原。胶原蛋白的基本单位称为原胶原蛋白，原胶原蛋白由三条相互缠绕的α-肽链构成，两端的非螺旋部分，称为末端肽，分别由16个氨基和26个羧基构成，称为氨基末端肽(NTx)和羧基末端肽(CTx)。大量临床试验和研究证明NTx与骨转移的累积范围及活动程度之间存在较强的相关性，其中尿液中I型胶原交联氨基末端肽(amino-terminaltelopeptideoftypeIcollagen，U-NTx)是骨吸收的一个敏感的和特异的指标，在预测骨量丢失趋势及疗效监测方面具有重要的价值。临床上一般使用电化学免疫法和ELISA法检测骨代谢标志物，这两种方法的检测时间过长，电化学免疫法的检测时间一般在45分钟以上，ELISA法的检测时间一般在1小时30分钟以上。并且，以上两种方法的操作较为复杂，需要特殊的设备，以及专业的检验人员操作才能完成。中国专利文献CN106370844A公开了一种人骨代谢标志物检测双胶体金试纸条及应用其的检测装置，其中试纸条包括样品垫、第一结合垫、第二结合垫和硝酸纤维素膜，第一结合垫涂覆有金标链霉亲和素，第二结合垫涂覆有金标生物素化抗体，金标链霉亲和素与金标生物素化抗体可以特异性地结合。在样品检测时，样本中的骨代谢标志物结合金标生物素化抗体，通过金标链霉亲和素与金标生物素化抗体放大胶体金产生的信号，实现了对血清骨钙素(OC)的高灵敏度检测。利用上述试纸条能够提高骨代谢标志物检测的效率与灵敏度，但其检测结果必须依靠金标定量阅读仪读取，需要专业人员使用，增加了骨代谢标志物的检测成本和检测步骤，不利于检测试纸的大规模普及应用。
技术实现思路
因此，本专利技术要解决的技术问题在于克服现有技术中的骨代谢标志物检测的胶体金试纸条必须依赖检测仪器确定检测结果，导致检测成本高、检测过程复杂；从而提供一种检测成本低、操作简单、不需要依赖设备，能够通过肉眼观测完成对NTX1半定量检测的试纸条。本专利技术提供了一种NTx检测试纸条，包括层析膜，所述层析膜的一端连接结合垫；所述结合垫上担载免疫标记的NTx抗体和免疫标记的第一抗体，所述层析膜上沿液体层析方向依次设有检测线和比色线，所述检测线上包被NTx蛋白，所述比色线上包被第二抗体，所述第二抗体特异性结合所述第一抗体。优选地，上述的NTx检测试纸条，所述检测线由0.6-0.8mg/ml的NTx蛋白以1.1μl/cm的液体量包被在所述检测线位置处形成，所述比色线由0.2-0.3mg/ml的第二抗体以1.0μl/cm的液体量包被在所述比色线位置处形成；所述结合垫上担载有点样量为16.7mg/cm2的免疫标记的NTx抗体溶液，以及点样量为16.7mg/cm2的免疫标记的第一抗体溶液，所述免疫标记的NTx抗体溶液和所述免疫标记的第一抗体溶液OD520nm大于0.8。优选地，上述的NTx检测试纸条，所述结合垫包括沿所述液体层析方向依次连接的第一结合垫和第二结合垫，所述第一结合垫上担载所述免疫标记的NTx抗体，所述第二结合垫上担载免疫标记的第一抗体。优选地，上述的NTx检测试纸条，所述免疫标记为胶体金标记、胶体砷标记、胶体碳标记、有色乳胶标记或荧光乳胶标记。进一步优选地，上述的NTx检测试纸条，所述免疫标记的第一抗体为胶体金标记的IgG抗体，所述第二抗体是以所述胶体金标记的IgG抗体为免疫原的IgG多克隆抗体。进一步优选地，上述的NTx检测试纸条，所述免疫标记的NTx抗体为胶体金标记的鼠抗人NTx单克隆抗体，所述免疫标记的第一抗体为胶体金标记的兔IgG多克隆抗体，所述第二抗体为羊抗兔IgG多克隆抗体。优选地，上述的NTx检测试纸条，所述层析膜上还设有质控线，沿所述液体层析方向上所述质控线位于所述比色线之后，所述质控线上包被第三抗体，所述第三抗体特异性结合所述NTx抗体。进一步优选地，上述的NTx检测试纸条，所述第三抗体为羊抗鼠IgG多克隆抗体。进一步优选地，上述的NTx检测试纸条，所述质控线由0.5-0.7mg/ml的羊抗鼠IgG多克隆抗体以1.0μl/cm的液体量包被在所处质控线位置处形成。优选地，上述的NTx检测试纸条，所述NTx检测试纸条还包括样品垫、调速垫、吸收垫和底板；所述底板上沿所述液体层析方向依次黏贴所述样品垫、所述第一结合垫、所述第二结合垫、所述调速垫、所述吸收垫和所述底板。进一步优选地，上述的NTx检测试纸条，所述调速垫由无纺布、玻璃纤维或聚酯膜制成，所述结合垫由玻璃纤维、聚酯膜或无纺布制成，所述层析膜由硝酸纤维素膜制成。本专利技术提供了一种NTx检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：a.向胶体金溶液中加入比例为8μg/g的鼠抗人NTx单克隆抗体，搅拌混匀后继续加入NTx稳定剂，搅拌混匀后离心，得到胶体金标记的鼠抗人NTx单克隆抗体；b.用NTX-A105溶液稀释步骤a得到的胶体金标记的鼠抗人NTx单克隆抗体，将OD520nm本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种NTx检测试纸条，其特征在于：包括层析膜(5)，所述层析膜(5)的一端连接结合垫(3)；所述结合垫(3)上担载免疫标记的NTx抗体和免疫标记的第一抗体，所述层析膜(5)上沿液体层析方向依次设有检测线(6)和比色线(7)，所述检测线(6)上包被NTx蛋白，所述比色线(7)上包被第二抗体，所述第二抗体特异性结合所述第一抗体。

【技术特征摘要】
1.一种NTx检测试纸条，其特征在于：包括层析膜(5)，所述层析膜(5)的一端连接结合垫(3)；所述结合垫(3)上担载免疫标记的NTx抗体和免疫标记的第一抗体，所述层析膜(5)上沿液体层析方向依次设有检测线(6)和比色线(7)，所述检测线(6)上包被NTx蛋白，所述比色线(7)上包被第二抗体，所述第二抗体特异性结合所述第一抗体。2.根据权利要求1所述的NTx检测试纸条，其特征在于：所述检测线(6)由0.6-0.8mg/ml的NTx蛋白以1.1μl/cm的液体量包被在所述检测线(6)位置处形成，所述比色线(7)由0.2-0.3mg/ml的第二抗体以1.0μl/cm的液体量包被在所述比色线(7)位置处形成；所述结合垫(3)上担载有点样量为16.7mg/cm2的免疫标记的NTx抗体溶液，以及点样量为16.7mg/cm2的免疫标记的第一抗体溶液，所述免疫标记的NTx抗体溶液和所述免疫标记的第一抗体溶液的OD520nm均大于0.8。3.根据权利要求1或2所述的NTx检测试纸条，其特征在于：所述结合垫(3)包括沿所述液体层析方向依次连接的第一结合垫(31)和第二结合垫(32)，所述第一结合垫(31)上担载所述免疫标记的NTx抗体，所述第二结合垫(32)上担载免疫标记的第一抗体。4.根据权利要求1-3任一项所述的NTx检测试纸条，其特征在于：所述免疫标记为胶体金标记、胶体砷标记、胶体碳标记、有色乳胶标记或荧光乳胶标记。5.根据权利要求4所述的NTx检测试纸条，其特征在于：所述免疫标记的第一抗体为胶体金标记的IgG抗体，所述第二抗体是以所述胶体金标记的IgG抗体为免疫原的IgG多克隆抗体。6.根据权利要求5所述的NTx检测试纸条，其特征在于：所述免疫标记的NTx抗体为胶体金标记的鼠抗人NTx单克隆抗体，所述免疫标记的第一抗体为胶体金标记的兔IgG多克隆抗体，所述第二抗体为羊抗兔IgG多克隆抗体。7.根据权利要求1-6任一项所述的NTx检测试纸条，其特征在于：所述层析膜(5)上还设有质控线(8)，沿所述液体层析方向上所述质控线(8)位于所述比色线(7)之后，所述质控线(8)上包被第三抗体，所述第三抗体特异性结合所述NTx抗体。8.根据权利要求7所述的NTx检测试纸条，其特征在于：所述第三抗体为羊抗鼠IgG多克隆抗体。9.根据权利要求8所述的NTx检测试纸条，其特征在于：所述质控线(8)由0.5-0.7mg/ml的羊抗鼠IgG多克隆抗体以1.0μl/cm的液体量包被在所处质控线(8)位置处形成。10.根据权利要求3所述的NTx检测试纸条，其特征在于：所述NTx检测试纸条还包括样品垫(2)、调速垫(4)、吸收垫(9)和底板(1)；所述底板(1)上沿所述液体层析方向依次黏所述贴样品垫(2)、所述第一结合垫(31)、所述第二结合垫(32)、所述调速垫(4)和所述吸收垫(9)。11.根据权利要求10所述的NTx检测试纸条，其特征在于：所述调速垫(4)由无纺布、玻璃纤维或聚酯膜制成，所述结合垫(3)由玻璃纤维、聚酯膜或无纺布制成，所述层析膜(5)由硝酸纤维素膜制成。12.一种NTx检测试纸条的制备方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：高克谨，林朝琨，焦艳，余期川，
申请(专利权)人：润和生物医药科技汕头有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44