L-脯氨酸4位羟基化酶的制备方法技术

Ｌ－脯氨酸４位羟基化酶的制备方法，其特征在于培养属于指孢囊菌属（Ｄａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ）或Ａｍｙｃｏｌａｔｔｏｐｓｉｓ属，且具有生产Ｌ－脯氨酸４位羟基化酶能力的微生物，通过阴离子交换色谱层析和疏水性色谱层析组合精制方法，精制所说的微生物的细胞提取液。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及工业上制造作为药品合成原料或食品添加剂的有用的反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法以及用于该方法的有用的新的L-脯氨酸4位羟基化酶。使用微生物制造反式-4-羟基-L-脯氨酸地方法已经公知的有1)使用属于大肠杆菌属(Escherichia)的微生物，从4-羟基-2-酮戊二酸制造反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法(特开平3-266995)，2)使用霉菌类直接发酵生产的方法(欧洲专利申请EP0547898A2)3)使用属于链霉菌属的微生物，从L-脯氨酸制造的方法〔Journal of Biological Chemistry(J.Biol.Chem)，254卷，6684-6690页(1979年)、Biochemical and Biophysical ResearchCommunication(Biochem.Biophys.Res.Comm.)，120卷，45-51页(1984年)〕。上述(1)的方法中，4-羟基-2-酮戊二酸昂贵而且难以得到，生产率低，(2)的方法生产率也低，而(3)的方法中，涉及制造反式-4-羟基-L-脯氨酸的酶的活性极其微弱，反应生成物是微量的，必须用放射性化合物才能检测出来，所以上述任何一种方法用在工业生产上都是困难的。对于催化生产反式-4-羟基-L-脯氨酸羟基化反应的酶，在不离析出的状态下，使用来自属于指孢囊菌属或者Amgcolatopsis属的微生物作为催化从L-脯氨酸向反式-4-羟基-L-脯氨酸羟基化反应的酶源，制备 反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法，目前尚未为人知。另外，曾有报导过从上述的链霉菌属的微生物精制L-脯氨酸4位羟基化酶〔(TetrahedronLetters)，34卷，7489-7492页(1993年)〕，但对于精制酶的方法，被精制酶的纯度以及酶的理化性质等均没有记载。总之，将游离的L-脯氨酸羟基化，催化生成反式-4-羟基-L-脯氨酸反应的L-脯氨酸4位羟基化酶，在此之前没有分离出，并且是理化性质不明确的酶。以往的反式-4-羟基-L-脯氨酸的制造方法有(1)原料昂贵，(2)反应工序多，(3)分离精制工序复杂，(4)生产率低等缺点，作为工业上的制造方法未必是满意的，所以需要一种在工业生产上有利的反式-4-羟基-L-脯氨酸的制造方法。本专利技术的目的在于提供一种利用发酵法将由糖源工业规模地生产出的L-脯氨酸作为原料，通过直接用微生物或酶进行羟基化处理后，工业规模地且方便地制造反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法及用于该方法的L-脯氨酸4位羟基化酶。按照本专利技术，可以提供反式-4-羟基-L-脯氨酸的制备方法及L-脯氨酸4位羟基化酶，其特征是将来自指孢囊菌属或Amycolatopsis属的微生物且能在L-脯氨酸的4位上催化羟基化反应的酶源、二价铁离子、2-酮戊二酸及L-脯氨酸存在于水溶性介质中，使得L-脯氨酸转化成反式-4-羟基-L-脯氨酸，而后从该水溶性介质中提取反式-4-羟基-L-脯氨酸的制造方法以及L-脯氨酸4位羟基化酶。本专利技术中所使用的酶源，只要是来自属于指孢囊菌(Dactylosporangium)属或Amycolatopsis属的微生物，且具有能羟基化L-脯氨酸，生成反式-4-羟基-L-脯氨酸的活性，任何的微生物培养物、菌体、菌体处理物、精制酶或粗酶都可以。作为微生物的合适例子可举出指孢囊菌、(Dactylopsorangium sp.)RH1、Amycolattopsis菌(Amycolatopsis sp.)RH2或这些菌株的继代培养物、突变体或诱变体等。RH1将是从东京都的树木、RH2株从埼玉县的土壤中由本专利技术者所分离出的微生物。以下说明RH1及RH2的菌学性质。1.形态的性质RH1及RH2在各种培养基上，在28℃下培养14天时的形态性质，表示在表1中表1形态的性质2.培养的性质RH1株在一般使用的合成及天然培养基上显示了普通程度或旺盛的生长。基生菌丝显示橙色。由于培养基的不同，也可能产生黄土色或淡红色的可溶性色素。RH2株在一般使用的合成及天然培养基上显示了普通程度或旺盛的生长。基生菌丝显示淡黄色或褐色，气菌丝显示白色或灰色。由于培养基的不同，也可能产生褐色的可溶性色素。RH1株及RH2株在各种培养基上，28℃下培养14天时的生长及颜色特征归纳在表2-(1)及表2-(2)中。另外颜色的表示是按Color Harmony Manual(Container Corporation ofAmerica)的颜色分类进行的。 表2-(1) 培养的性质 表2-(2)培养的性质3.生理学性质RH1株及RH2株的生理学性质归纳在表3中。生长温度范围是用液体振盗培养7天后的温度，表中的其他项目是在28℃，2-3周后的结果。 表3 生理学的性质*基础培养基使用了布里特哈姆·戈特利布琼脂培养基。+表示可利用，-表示不可利用，而(+)表示怀疑是否可利用。*基础培养基使用了布里特哈姆·戈特利布琼脂培养基。+表示可利用，-表示不可利用，而(+)表示怀疑是否可利用。4.化学分类学的性质RH1株及RH2株的化学分类学性质如表4所示。 表4 化学分类学的性质以上，从RH1株在形态上不形成气菌丝、在基生菌丝上形成棒状的胞子囊，胞子囊中含有2-4个具有运动性的胞子，含在细胞壁中的二氨基庚二酸，化学分类上是3-羟基-二氨基庚二酸，作为全菌体加水分解物中的还原糖，含有阿拉伯糖及木糖这些事实，RH1株被分类在放线菌中的指孢囊菌属(Dactylosporangium)。从RH2株，在形态上形成气菌丝；气菌丝和基生菌丝分断；作为细胞壁的二氨基庚二酸，化学分类上是间位(meso)庚二酸，但作为还原糖含有半乳糖及微量阿拉伯糖；作为全菌体加水分解物中的还原糖，含有阿拉伯糖及半乳糖；作为菌体成分不含有霉菌酸；作为磷脂质含有磷脂酰乙醇胺，但不含有磷脂酰胆碱及未知的带有葡糖胺的磷脂质；甲基苯醌类主要成分是MK-9(H4)，从以上事实RH2株被分类在放线菌中的Amycolatopsis等。RH1株命名为指孢囊菌株(Dactylosporangium sp.)RH1，RH2株命名为Amycolatopsis菌株(Amycolatopsis sp.)RH2，根据布达佩斯条约，RH1株于平成5年9月1日寄存到工业技术院生物工程工业技术研究所，寄存号为FERM BP-4400，同样RH2株于平成6年2月22日也寄存到上述机构，寄存号为FERM BP-4581。这些培养微生物的培养基，只要是含有微生物可利用的碳源、氮源、无机盐类等，并能高效地培养具有催化活性的微生物，即在羟基化L-脯氨酸后，可以催化生成反式-4-羟基-L-脯氨酸反应的活性，无论是天然培养基，合成培养基都可以。作为碳源，可以培养各种微生物的就可以，如葡萄糖、果糖、蔗糖、含有这些糖类的糖蜜、淀粉或者淀粉加水分解物等的碳水化合物、醋酸、丙酸等的有机酸、乙醇、丙醇等的醇类。作为氮源可以使用氨、氯化铵、硫酸铵、醋酸铵、磷酸铵等的各种无机酸和有机酸铵盐、其他的含氮化合物以及胨、肉汁、酵母浸汁、玉米粉浸汁、酪蛋白加水分解物、大豆渣子及大豆渣子加水分解物、各种发酵菌体及其消化物等。作为无机物，可使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
Ｌ－脯氨酸４位羟基化酶的制备方法，其特征在于培养属于指孢囊菌属（Ｄａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ）或Ａｍｙｃｏｌａｔｔｏｐｓｉｓ属，且具有生产Ｌ－脯氨酸４位羟基化酶能力的微生物，通过阴离子交换色谱层析和疏水性色谱层析组合精制方法，精制所说的微生物的细胞提取液。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：尾崎明夫，森英郎，柴崎刚，安藤胜彦，千叶繁，
申请(专利权)人：协和发酵工业株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]