利用基因化学诱导调控系统提高重组真菌安全性的方法技术方案

一种利用基因化学诱导调控系统提高重组真菌安全性的方法，其特征在于，依次包括下列步骤： （１）组成型表达调控蛋白ＧＶＧＥｃ的真菌表达载体的构建 ①用ＢａｍＨＩ从含有调控蛋白ＧＶＧＥｃ的载体ｐＭＦ６ＧＲＶＰ１６ＨｅｃＲ上，切下并回收２．２ｋｂ的、编码调控蛋白的基因片段ＧＲＡｃｔ－ＶＰ１６－ＧＲＤＢＤ－ＨｅｃＲ； ②ＢａｍＨＩ酶切ｐＢＳＰＭＴ↑［ｎ］载体，并去磷酸化，该载体含有构巢曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）３－磷酸甘油醛脱氢酶基因的组成型启动子ＰｇｐｄＡ，以及色氨酸基因的终止子ＴｔｒｐＣ； ③将上述步骤①中的ＧＲＡｃｔ－ＶＰ１６－ＧＲＤＢＤ－ＨｅｃＲ片段连入步骤②中的去磷酸化ｐＢＳＰＭＴ↑［ｎ］载体，选择正向插入的克隆，得到中间载体ｐＢＳ－Ｐ－ＧＶＧＥｃ－Ｔ； ④用ＸｂａＩ／ＨｉｎｄⅢ从上述ｐＢＳ－Ｐ－ＧＶＧＥｃ－Ｔ载体上切下５．２ｋｂ的ＰｇｐｄＡ－ＧＶＧＥｃ－ＴｔｒｐＣ片段，回收； ⑤上述步骤④的片段连入用ＸｂａＩ／ＨｉｎｄⅢ处理的真菌表达载体ｐＢＡＮＦ－Ｂａｒ中，得到组成型表达调控蛋白ＧＶＧＥｃ的真菌表达载体ｐＢＡＮＦ－Ｂａｒ－ＰＧＶＧＥｃＴ，该表达载体以抗除草剂基因ｂａｒ作为选择标记基因，转化真菌后用除草剂筛选转化子； （２）真菌中受蜕皮激素诱导的诱导型启动子的构建 ①通过对构巢曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）３－磷酸甘油醛脱氢酶基因的组成型启动子ＰｇｐｄＡ，进行启动子分析，确定其Ｍｉｎｉｍａｌ启动子（ＭＰ）的序列；Ｍｉｎｉｍａｌ启动子的全序列如下，全长８５ｂｐ： ＣＴＣＴＴＴＴＣＴＴＴＴＣＴＣＴＴＴＣＴＴＴＴＣＣＣＡＴＣＴＴＣＡＧＴＡＴＡＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＡＴＣＣＡＡＧＡＡＣＣＴＴＴＡＴＴＴＣＣＣＣＴＡ ②设计酶切位点，合成ＭＰ５’端引入ＨｉｎｄⅢ、ＢｇｌⅡ位点（ＡＡＧＣＴＴＡＧＡＴＣＴ），３’端引入ＳｍａⅠ位点（ＣＣＣＧＧＧ），完成后的ＭＰ序列为： ＡＡＧＣＴＴＡＧＡＴＣＴＣＴＣＴＴＴＴＣＴＴＴＴＣＴＣＴＴＴＣＴＴＴＴＣＣＣＡＴＣＴＴＣＡＧＴＡＴＡＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＡＴＣＣＡＡＧＡＡＣＣＴＴＴＡＴＴＴＣＣＣＣＴＡＣＣＣＧＧＧ ③将上述ＭＰ寡聚核苷酸双链用ＨｉｎｄⅢ／ＳｍａⅠ双酶切之后，连入含色氨酸基因终止子ＴｔｒｐＣ的载体Ｘａ－ＴｔｒｐＣ，该载体Ｘａ－ＴｔｒｐＣ同样也用ＨｉｎｄⅢ／ＥｃｏＲＶ处理，由此得到含ＭＰ和ＴｔｒｐＣ的中间载体ｐＸａ－ＭＰ－ＴｔｒｐＣ； ④将目的基因插入ｐＸａ－ＭＰ－ＴｔｒｐＣ，得到中间载体ｐＸａ－ＭＰ－ＧＵＳ－Ｔｔｒ…。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种运用化学诱导基因调控系统来控制外源基因在重组微生物中的基因表达，从而同步解决重组菌株高效表达与安全性的方法。
技术介绍
随着人口的增长和社会生活水平的提高，人们对生活的质量提出了更高的要求。转基因技术能打破物种界线，实现遗传信息在不同物种间的交流，从而创造出更加符合我们要求的食品、药物等产品。但是，另一方面，正是由于原有生殖隔离界线被打破，转基因技术在给人类带来巨大经济效益和福利的同时，也可能由于外源基因的引入，给人类健康和生存环境造成潜在的危害。与植物等相比，重组微生物的控制更加困难。特别是许多真菌(包括工业、农业、医药和环境用真菌)，这些真菌的遗传改良可以产生巨大的经济与社会效益。但是，由于其产生的孢子通过空气和其他媒介传播，重组菌株一旦释放到环境后就难以控制，其安全性更值得重视。对于杀虫真菌等需要释放到环境中去的微生物来说，一方面我们希望杀虫微生物对害虫有很高的毒力，能在使用后尽快击倒害虫。另一方面，从生物安全性角度上考虑，我们希望重组微生物在杀死害虫后，外源基因不再表达，恢复到野生型状态，以维护生物的多样性，同时达到提高杀虫微生物毒力与安全性之目的。但是，迄今为止，还未见提高重组真菌安全性技术的报道。基因表达的化学诱导调控系统具有基因表达水平高、可以人为控制等优点。其基本原理是，把目的基因置于一套双重启动子的控制之下，控制目的基因转录的启动子需要另一转录因子的激活才能启动，而转录因子的启动则受非真菌源的化学物质的诱导。换言之，目的基因的转录，受某一化学因子的诱导，当施用这种化学物质时，基因就表达，不施用时，该基因就不表达。因此，化学诱导基因表达系统的最大优点是，通过化学诱导物质的施用，实现对基因定时、定位表达的精确控制。目前，已获成功的化学诱导系统主要有TetR，tTA，GVG，XVE，TGV等，其中，GVG系统是以哺乳动物的糖皮质激素(Glucocorticoid)地塞米松(Dexamethasone)为诱导因子，报道较多。Chua Nam Hai等(1997)将GVG系统用于烟草，经地塞米松诱导后转基因烟草中，报告基因的表达水平提高了100倍。但它的主要缺点是地塞米松具有毒性，限制了其应用。近年来，不断有新的诱导系统推出。其中值得注意的是Martinez等的GVGEc系统，其特点是以来自烟芽夜蛾(Hliothis uirescens)的蜕皮激素受体构建激活子，用一种防治鳞翅目害虫的蜕皮激素类似物RH5992作诱导，转基因烟草的报告基因表达水平提高了400倍，是35S的1.5倍。该系统在植物中已有成功应用的报道。诱导效率令人满意。目前尚无基因表达的化学诱导调控系统在杀虫真菌中应用的报导。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种。该方法提出利用化学诱导调控系统来控制真菌重组菌株的基因表达，把非真菌源的化学物质(如昆虫蜕皮激素、高等哺乳动物糖皮质激素)为诱导物的基因表达化学诱导系统引入丝状真菌，对其基因表达实现精确控制，以同步解决重组菌株的基因高效表达与安全性问题。本专利技术的基本思路是将受非真菌源的化学物质，如昆虫蜕皮激素(Ecdysone)、地噻米松(Dexamethasone)等诱导的基因化学调控系统引入杀虫真菌中，使其下游基因的表达受诱导物的控制。这一系统的建立主要包括三个主要部分1.组成型表达调控蛋白GVGEc的真菌表达载体的构建。2.置于诱导型启动子下的目的基因引入上述真菌表达载体。3.诱导目的基因的表达。本专利技术的内容为用真菌的组成型启动子PgpdA(gpd promoter from Aspergillusnidulans)组成性的表达GVGEc系统的调节蛋白，将目的基因置于受调控的启动子下游，这一人工合成的启动子由几个重复的能与调节蛋白特异结合的操纵子序列和PgpdA的Minimal启动子序列连接而成。完成后的表达载体如图所示 PgpdAgpdA promoter from Aspergillus nidulansGRActGlucocorticoid receptor activationVP16the transcription domain of Herpes simplex virus protein 16GRDBDGlucocorticoid receptor DNA binding domainHecR LBDHeliothis ecdysone receptor ligand binding domainTtrpCtrpC termitorGREGlucocorticoid receptor response elementMPMinimal promoter of Pgpd A本专利技术依次通过下列步骤实现(1)组成型表达调控蛋白GVGEc的真菌表达载体的构建①用BamHI从含有调控蛋白GVGEc的载体pMF6GRVP16HecR上，切下并回收2.2kb的、编码调控蛋白的基因片段GRAct-VP16-GRDBD-HecR；②BamHI酶切pBSPMTn载体，并去磷酸化，该载体含有构巢曲霉(Aspergilliusnidulans)3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的组成型启动子PgpdA，以及色氨酸基因的终止子TtrpC；③将上述步骤①中的GRAct-VP16-GRDBD-HecR片段连入步骤②中的去磷酸化pBSPMTn载体，选择正向插入的克隆，得到中间载体pBS-P-GVGEc-T；④用XbaI/HindIII从上述pBS-P-GVGEc-T载体上切下5.2kb的PgpdA-GVGEc-TtrpC片段，回收；⑤上述步骤④的片段连入用XbaI/HindIII处理的真菌表达载体pBANF-Bar中，得到组成型表达调控蛋白GVGEc的真菌表达载体pBANF-Bar-PGVGEcT，该表达载体以抗除草剂基因bar作为选择标记基因，转化真菌后用除草剂筛选转化子；(2)真菌中受蜕皮激素诱导的诱导型启动子的构建①通过对构巢曲霉(Aspergillius nidulans)3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的组成型启动子PgpdA，进行启动子分析，确定其Minimal启动子(MP)的序列；Minimal启动子的全序列如下，全长85bpCTCTTTTCTTTTCTCTTTCTTTTCCCATCTTCAGTATATTCATCTTCCCATCCAAGAACCTTTATTTCCCCTA②设计酶切位点，合成MP5’端引入HindIII、BglII位点(AAGCTTAGATCT)，3’端引入SmaI位点(CCCGGG)，完成后的MP序列为AAGCTTAGATCTCTCTTTTCTTTTCTCTTTCTTTTCCCATCTTCAGTATATTCATCTTCCCATCCAAGAACCTTTATTTCCCCTACCCGGG③将上述MP寡聚核苷酸双链用HindIII/SmaI双酶切之后，连入含色氨酸基因终止子TtrpC的载体Xa-TtrpC，该载体Xa-TtrpC同样也用HindIII/EcoRV处理，由此得到含MP和TtrpC的中间载体pXa-MP-TtrpC；④将目的基因插入pXa-MP-TtrpC，得到中间载体pXa-MP-GUS-TtrpC；⑤用HindIII/Bam本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：裴炎，张永军，郑雪莲，方卫国，
申请(专利权)人：西南农业大学，
类型：发明
国别省市：