结合生物材料的表面改性载体材料、其制备方法和用途技术

本发明专利技术涉及结合生物材料的表面改性的载体材料，其制备方法以及其分离和纯化核酸，尤其是质粒ＤＮＡ的用途。本发明专利技术载体材料的特征在于其表面上具有带负电荷官能团的聚合物层。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及结合生物材料的表面改性载体材料，其制备方法以及分离和纯化核酸，尤其是质粒DNA的用途。本专利技术载体的特点是在其表面上具有带负电荷官能团的聚合物层。在现代生物化学和生物技术的所有领域中，生物材料，尤其是多核苷酸的分离和纯化发挥着相当重要的作用。人们对采用有效的溶解方式分离和纯化核酸的要求越来越高。主要的技术困难在于从细菌裂解物中分离出质粒DNA。采用现有技术中极其简单的化学方法可以从细菌裂解物中分离出质粒DNA。对此，将细菌沉积物在由葡糖、Tris-HCl以及EDTA组成的缓冲液中再悬浮，接着用SDS/NaOH缓冲液溶解，并用由乙酸钾或乙酸钠组成的缓冲液中和。中和反应导致复合，随后沉淀出染色体的DNA和蛋白质，它们经离心分离步骤沉积出来。形成的上清液中含有质粒DNA，添加一种醇后形成沉淀，接着进行洗涤、干燥，将最终获得的质粒DNA沉积物水化在Tris缓冲液中。该方法极为简单并且成本低廉，无需采用对生态环境和毒物学中有不利影响的物质。但是，该方法很难实现自动化，靠许多人工处理的步骤很耗时。工业上行之有效的分离质粒DNA的方法(也包括全自动化分离)是采用高效膜技术结合核酸。离液剂离子主要用来结合核酸。专业人员都了解用作缓冲液组分的离液剂盐破坏氢桥键的三维结构，导致生物分子中形成空间结构(例如二级结构、三级结构或四级结构)的分子内的结合力减弱。由于含水介质中上述结构的这种破坏，核酸吸附在矿物材料，尤其是玻璃颗粒或二氧化硅颗粒的表面上。现有技术应用中采用的固相仅仅包括硅载体、硅藻土或玻璃，这类材料在核酸萃取工艺中是以滤膜或悬浮液的形式存在的。为了分离核酸，总是在反应混合物中使核酸与含离液剂盐的溶液复合，以便分离或纯化所需的核酸。离液剂盐是在中和反应后作为额外的缓冲组分添加到反应过程中的，或者已经构成中和缓冲液的组分。然后，不是将清澈的离心分离的上清液输送到乙醇沉淀物中，而是将其与固相(玻璃材料；二氧化硅材料)混合，结合在该固相上，接着进行洗涤，最后借助缓冲液微弱的离子强度又从固相中洗提出来。尽管该方法实施起来简单，省时并且在采用结合膜时可完全实现自动化，但是，使用的离液剂缓冲液组分昂贵，并且危害健康和环境。DE 197 46 874A1公开了一种使用疏水膜结合核酸的方法，该膜是用来分离RNA的，采用已知的离液剂盐作为结合用的反应组分。另一种采用固相萃取法纯化DNA分子的方法同样是人们熟悉的，该方法在DNA的结合中未采用离液剂离子。在经化学改性反应，带正电荷离子的化学改性的固相上进行核酸的结合。这样，在所用膜带正电荷的表面和核酸的磷酸盐柱的带负电荷离子之间通过库仑交换作用发生结合(US 5523392A；在硅酸铝和磷硅酸盐上纯化DNA；US5503816A；纯化DNA的硅酸盐化合物；US5674997A；在改性的硅酸盐上纯化DNA；US5438127A；采用PCl3改性的玻璃纤维膜经固相萃取纯化DNA；US5606046A；采用三氟乙酸洗涤的玻璃纤维膜经固相萃取纯化DNA；US5610291A；用SiCl4、AlCl3或BCl3进行处理，改性玻璃纤维膜并用作为DNA吸附剂的NaOH洗涤；US5616701A；采用氢氧化物洗涤的玻璃纤维膜经固相萃取纯化DNA；US5650506A；用于固相萃取纯化DNA的改性玻璃纤维膜)。在专业界，人们十分熟悉的原理是在带正电荷的固相上结合核酸，例如，在DNA/RNA印迹技术中，多年来，在常规的应用中，它们被结合在带正电荷的尼龙滤器上。但是，采用膜的先决条件是核酸已经以分离的形式存在。在形成的带正电荷的官能化表面上，可通过库仑交换作用将事先分离的核酸结合在膜上。本专利技术的目的是专利技术并提供载体材料，借助该材料可按传统的化学方法分离生物材料，尤其是分离和纯化核酸，并通过结合将它们复合在固相上，而未使用有危害的物质，例如离液剂盐，且可高效自动化地实施该方法。令人惊奇地是，与迄今提供的模式不同，本专利技术的目的是通过载体材料表面的官能化实现的，其特征在于载体的表面上带有负电荷。同样令人惊奇地是，将本专利技术的方法与传统的化学方法组合，可实现在固相上结合生物材料，尤其是使用分离和纯化核酸，特别是分离和纯化质粒DNA的带负电荷的官能化载体。本专利技术根据权利要求书实现。按照本专利技术，对固态载体进行预处理，使固态载体与单体溶液聚合性酸或其衍生物接触，在载体表面上进行接枝聚合。最好用由强碱性的物质，例如碱性氢氧化物或碱性酰胺，和一种醇组成的碱性溶液对载体进行预处理，其中碱与醇的比例为1∶2-1∶10000(0.01％)。预处理的最长时间为24小时，优选约1-2小时。接着洗涤载体直到洗涤水呈中性。然后进行干燥。为了进行聚合，在引发剂的存在下，将载体浸入聚合性酸的单体溶液中，湿法照射，照射后进行洗涤并干燥。因此，本专利技术的目的是提供结合生物材料的表面改性的载体材料，其特征在于在载体的表面上有一层带负电荷官能团的层。本专利技术的另一目的是提供载体材料的制备方法和其分离核酸，尤其是质粒DNA的用途。本专利技术中的载体材料是矿物/无机载体材料，它们既可以是多孔的，也可以是无孔的。优选的载体材料是硅载体、硅藻土或玻璃材料，它们是以膜、绒、粉末、粒状、球或颗粒等形式存在的。但是，载体材料也可使用有机聚合物，例如聚丙烯、聚乙烯、聚砜、聚醚砜、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯腈、纤维素和其衍生物，聚酰胺、聚二酰亚胺、聚四氟乙烯、聚偏二氟乙烯、聚酯、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰基酰胺等，以及聚合物的共聚物或混合物。根据本专利技术，载体表面上带负电荷基团的层是聚合物层，是由聚合性酸或其混合物形成的。优选的聚合物层是羧酸、磺酸-和/或磷酸衍生物，尤其是丙烯酸、甲基丙烯酸、苯乙烯磺酸和苯乙烯磷酸、丙烯酰胺丙烷磺酸的衍生物或其混合物。在特别优选的实施方案中，载体是玻璃纤维绒，其表面上有一层丙烯酸聚合物层、碱金属丙烯酸盐的聚合物层或2-丙烯酰胺-2-甲基丙烷磺酸酯的聚合物层。在另一优选的实施方案中，载体是以玻璃纤维的空心纤维膜形式存在的，其表面上有聚合物层。下面详细介绍本专利技术的方法。在方法的第一步中，将任一种载体材料在室温下浸入每1000克醇，优选异-丙醇的0.1-500克苛性钠、苛性钾或其它强碱性物质的溶液中，浸入时间为1分钟-2小时，优选1小时。接着最好用水洗涤除去带醇溶液的载体材料，直到洗液呈中性，在100℃下优选干燥30分钟。在后续的第二步中，用一种光敏引发剂，优选二苯甲酮或其衍生物涂覆经预处理的载体。使用的引发剂溶剂是酮、醇、酯和醚。引发剂的浓度优选为0.01-0.5克/升。将经预处理并带有引发剂的载体材料浸入一种单体溶液中，从单体溶液中取出，在潮湿环境下进行光照。所用单体是所有可聚合的羧酸-、磺酸-和磷酸衍生物，尤其是丙烯酸、甲基丙烯酸、苯乙烯磺酸、苯乙烯磷酸、丙烯基酰氨基丙烷磺酸的衍生物或它们的混合物。用于单体的溶剂是醇、酮、酯、醚和优选的水以及它们的混合物。单体的浓度优选为1-200克/升，溶液中单体的浓度最好为50克/升。使用的光照源优选汞蒸汽灯、汞高压灯、卤素灯、钨丝灯和在引发剂吸收范围内发生辐射的激光器。光照时间由辐射源的强度决定，并根据其功率，进行一瞬间至数小时光照。光照完成后，洗涤载体材料。用于制备单体本文档来自技高网...

【技术保护点】
结合生物材料的表面改性的载体材料，其特征在于：所述载体材料的表面上有一层带负电荷官能化基团的层。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：蒂莫希勒布兰德，彼得本扎科，海克马图丘希，乌韦舍德勒，托马斯蒂勒，
申请(专利权)人：茵微特克有限公司，博利安特殊用途和分析聚合物制作有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]