猪链球菌9型抗体的PPA‑ELISA检测试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种猪链球菌9型抗体的PPA‑ELISA检测试剂盒及其制备方法。所述检测试剂盒包括酶标二抗和猪链球菌9型抗原蛋白，酶标二抗为辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白。检测试剂盒的制备方法包括：制备猪链球菌9型抗原蛋白：将猪链球菌9型菌悬液接入培养基中培养一段时间后，离心洗涤后悬浮于培养基中，1～1.5×10

PPA ELISA detection kit and preparation method thereof of Streptococcus suis type 9 antibody

PPA ELISA detection kit and a preparation method thereof. The invention discloses a Streptococcus suis type 9 antibody. The detection kit includes enzyme labeled two and Streptococcus suis type 9 antigen protein, and the enzyme marker two is a horseradish peroxidase labeled staphylococcal A protein. The preparation methods of the detection kit include: preparation of Streptococcus suis type 9 antigen protein: Streptococcus suis type 9 suspension suspension into the culture medium for a period of time, then centrifugally washed and suspended in the medium, 1 to 1.5 x 10.

【技术实现步骤摘要】
猪链球菌9型抗体的PPA-ELISA检测试剂盒及其制备方法
本专利技术涉及动物疾病诊断领域，具体的说是一种可快速检测猪链球菌9型抗体的ELISA诊断试剂盒及其制备方法。
技术介绍
猪链球菌是一种具有荚膜的革兰氏阳性菌，可致败血症、猪脑膜炎、肺炎和突然死亡等症状，也可通过受损的皮肤黏膜而感染人类，严重可致人死亡，是一种重要的人畜共患传染病病原菌。根据其荚膜多糖抗原(CPS)可将其分为35个血清型(1～34型和1/2型)，其中1型、2型、7型和9型是猪的致病菌。1998年和2005年分别在江苏和四川地区暴发人感染2型并致死亡的事件，危害严重。2005-2007年修福晓等分别从广东，上海，江苏，江西等地的病猪脑积液还有健康猪的扁桃体中分离检测到猪链球菌9型(Streptococcussuistype9，SS9)。近些年来，在中国的发病猪中也经常分离出SS9且呈上升趋势，国内猪群除了2型外，9型也是重要的致病菌。目前，猪链球菌的毒力因子的研究大都集中于猪链球菌2型，猪链球菌9型的相关研究很少。因此，建立一种敏感、快速、特异的猪链球菌9型检测方法，对该病的预防、诊断和治疗具有非常重要的意义。猪链球菌血清学检测方法主要包括间接血凝试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)和补体结合试验。补体结合试验参与反应的成分多，操作步骤繁琐；间接血凝试验敏感性不高，容易产生自凝而使试验结果受到影响。由于间接ELISA方法的敏感性高、特异性好，所以常用于血清学检测。目前，国内对猪链球菌的研究大多集中于2型，而对SS9抗体检测的研究相对匮乏。进口的猪链球菌9型抗体检测试剂盒价格十分昂贵且特异性不是很好，而国内市场又没有此类产品。与此同时，在SS9疫苗的研发过程中，经常用到猪，小鼠，兔子，豚鼠等多种动物，亟需要一种可以同时检测多种动物SS9抗体检测方法，来简化研发过程。而目前市面上，尚无此类产品。
技术实现思路
专利技术目的：为解决现有技术中的问题，本专利技术的目的之一是提供一种特异性强、灵敏度高的猪链球菌9型抗体的PPA-ELISA检测试剂盒；本专利技术的另一目的是提供上述检测试剂盒的制备方法。技术方案：本专利技术所述的猪链球菌9型抗体的PPA-ELISA检测试剂盒，包括酶标二抗和猪链球菌9型抗原蛋白，酶标二抗为辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白。进一步的，所述的猪链球菌9型抗体的PPA-ELISA检测试剂盒还包括：阳性血清对照和阴性血清对照。进一步的，所述的猪链球菌9型抗体的PPA-ELISA检测试剂盒还包括：酶标板、包被缓冲液、封闭液、底物液、洗涤液和终止液。所述的阳性血清对照、阴性血清对照来源于兔子。所述猪链球菌9型抗原蛋白由如下方法制备：将猪链球菌9型菌悬液接入培养基中培养一段时间后，离心洗涤后悬浮于培养基中，1～1.5×105Pa高压10～20min，离心取上清液即得猪链球菌9型抗原蛋白。所述的包被缓冲液为0.04～0.06mol/L、pH9.5～9.7的碳酸盐缓冲液，优选为0.05mol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲液。所述的封闭液为质量分数为4.5～5.5％优选为5％的脱脂奶粉溶液，溶剂为生理盐水。所述的底物液为OPD-H2O2-磷酸盐缓冲液，具体配制方法为：用10mL底物液时准确称量4mg领苯二胺(OPD)，溶解于5mL双蒸水后，取A液2.43mL和B液2.57mL加入，待充分溶解后加入30％过氧化氢20μL混匀，其中A液为0.1mol/L柠檬酸水溶液，B液为0.2mol/LNa2HPO4·12H2O水溶液。所述的洗涤液为含质量分数0.05～0.06％吐温-20的PBS缓冲液，优选为含质量分数0.05吐温-20的PBS缓冲液。所述的终止液为2～2.5mol/LH2SO4，优选为2mol/LH2SO4。上述试剂配合使用可达到最佳的实验结果。本专利技术还提供了所述的猪链球菌9型抗体的PPA-ELISA检测试剂盒的制备方法，包括：(1)制备猪链球菌9型抗原蛋白：将猪链球菌9型菌悬液接入培养基中培养一段时间后，离心洗涤后悬浮于培养基中，1～1.5×105Pa高压10～20min，离心取上清液即得猪链球菌9型抗原蛋白；(2)配制试剂盒的其他试剂。步骤(1)中，每500mL培养基接入500～600μL所述的菌悬液，所述的培养基为THB培养基；培养时为震荡培养，培养温度为35～37℃，培养时间为16～18h；洗涤时采用PBS进行洗涤。步骤(1)中，高压的条件优选为1×105Pa高压15min，高压后离心的转速为2900～3100r/min，时间为10～15min，优选的，转速为3000r/min，时间为10min。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：间接ELISA试验快速和结果稳定，同时可以达到很高的灵敏度，同其他诊断技术相比，该方法更加适用于临床实践。本专利技术中试剂盒所用酶标二抗为辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白(SPA)，SPA不仅与血清IgG的FC段有很强的结合力，同时还能与血清中少量的IgM和IgA结合，使本试剂盒很高的敏感性。本专利技术中试剂盒所用酶标二抗SPA与用辣根过氧化物酶标记IgG作为二抗相比，具有制备容易、性质稳定、易纯化、与抗原结合力强、易于被辣根过氧化物酶标记等优点，有助于提高试剂盒的保存期和利于其规模化组装生产。用酶标SPA代替二抗建立PPA-ELISA，可同时对豚鼠、家兔、猪血清进行检测，结果反应灵敏，避免了使用多种二抗造成的麻烦，缩短了反应时间，使用多种动物研发SS9疫苗提供了可靠的工具。本试验运用高压法处理抗原，不需要昂贵的仪器，处理步骤较为简单。本专利技术的试剂盒具有操作简单，检测快速、成本低廉等特点，体现了既继承传统又敢于创新的思想，适合于大量动物血清的普查，可在实际生产中广泛推广使用。附图说明图1SS9间接ELISA结果阳性阴性颜色对比；图2本专利技术PPA-ELISA的技术路线；图3猪链球菌9型菌株于血平板上复苏图片；图4考马斯亮蓝法测定蛋白含量标准曲线。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐明本专利技术，应理解这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围，在阅读了本专利技术之后，本领域技术人员对本专利技术的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。本专利技术具体实施方式所用材料如下：1、菌株猪链球菌9型(JZLQ分035)菌株，于某地临床病猪分离出，由山东绿都生物科技有限公司提供，后于江苏农林职业技术学院动物疾病检测中心保存。2、实验动物家兔2只，90日龄，清洁级，每只2.0-2.5kg。试验前先用ELISA方法检测下，结果其为猪链球菌9型阴性。单笼饲养，每顿喂饲料150g，一日喂食两次，观察一周，确保健康后使用。3、血清3.1阳性和阴性血清的制备选取两只健康兔子，实验前先用血凝实验检测兔子血清的SS9抗体，将血清为阴性的兔子选取为实验动物。经过检测，两只均可作为实验动物，一只准备制备阴性血清注射等量的PBS；另一只准备制备阳性血清。初免用加了弗氏完全佐剂的抗原，2mL/只肌肉注射；7天后用加了弗氏不完全佐剂的抗原肌肉注射，2mL/只；14天后肌肉注射不加佐剂的抗原，2mL/只；21天后静脉注射不加佐剂的抗原2mL/只，每次含菌量不低于2.75×107CFU/mL。在免疫的0、7、14、21、28天用间接ELISA法本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪链球菌9型抗体的PPA‑ELISA检测试剂盒，包括酶标二抗和猪链球菌9型抗原蛋白，其特征在于，酶标二抗为辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种猪链球菌9型抗体的PPA-ELISA检测试剂盒，包括酶标二抗和猪链球菌9型抗原蛋白，其特征在于，酶标二抗为辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白。2.根据权利要求1所述的猪链球菌9型抗体的PPA-ELISA检测试剂盒，其特征在于，还包括：阳性血清对照和阴性血清对照。3.根据权利要求2所述的猪链球菌9型抗体的PPA-ELISA检测试剂盒，其特征在于，还包括：酶标板、包被缓冲液、封闭液、底物液、洗涤液和终止液。4.根据权利要求2所述的猪链球菌9型抗体的PPA-ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性血清对照、阴性血清对照来源于兔子。5.根据权利要求1所述的猪链球菌9型抗体的PPA-ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述猪链球菌9型抗原蛋白由如下方法制备：将猪链球菌9型菌悬液接入培养基中培养一段时间后，离心洗涤后悬浮于培养基中1～1.5×105Pa高压10～20min，离心取上清液即得猪链球菌9型抗原蛋白。6.根据权利要求3所述的猪链球菌9型抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙智远，蒋敏华，陈军，徐孝宙，杨剑波，张旭晖，赵勇，张萍，
申请(专利权)人：江苏农林职业技术学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32