具有骨骼肌刺激活性和免疫调节作用的趋化素样因子超家族制造技术

本发明专利技术涉及新的具有骨骼肌刺激活性和免疫调节作用的趋化素样因子超家族的核苷酸序列与氨基酸序列，生产趋化素样因子超家族的方法及含有趋化素样因子超家族的载体与宿主细胞。本发明专利技术还涉及趋化素样因子超家族成员的抗体，含有趋化素样因子超家族的药物组合物，以及拮抗剂和激活剂。本发明专利技术的趋化素样因子超家族的多核苷酸和多肽在治疗肌肉萎缩或其它退行性病变，造血系统疾病和／或免疫系统疾病方面具有重要意义。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞因子。更具体地说，本专利技术涉及新的具有骨骼肌刺激活性和免疫调节作用的趋化素样因子超家族的核苷酸序列与氨基酸序列，生产趋化素样因子超家族的方法及含有趋化素样因子超家族的载体与宿主细胞。本专利技术还涉及趋化素样因子超家族的抗体，含有趋化素样因子超家族的药物组合物，以及拮抗剂和激活剂。本专利技术进一步涉及趋化素样因子超家族的多核苷酸和多肽在制备肌肉萎缩或其它退行性病变，造血系统疾病和/或免疫系统疾病的药物组合物中的应用。细胞因子具有多种生理功能它们可以调节机体的免疫功能，参与细胞的增殖与分化，促进血管内皮细胞增殖和新生血管生成，在抗肿瘤和抗微生物感染方面也具有重要意义。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，人们对细胞因子及其受体的结构功能有了更深入的了解，利用基因工程技术生产的重组细胞因子及其拮抗剂已经作为药物用于临床，并取得良好疗效。如髓样造血祖细胞抑制因子1(MPIF-1)作为造血保护剂用于肿瘤大剂量放、化疗中，有望成为新一代的生物工程药物(MarshallA，HGS Launches“first”genomics product in clinic.Nat Biotechnol 1998，16129)。这提示细胞因子在肿瘤、造血功能障碍性疾病、自身免疫性疾病等疑难病症的治疗中具有广阔的应用前景。趋化因子(chemokine，又称趋化素)，是一类结构相似，分子量8-12KD，具有细胞趋化作用的小分子多肽，它们在机体的免疫防御、免疫调节、炎症反应、造血调节、血管生成等方面具有重要作用。趋化素样因子(chemokine-like factor，CKLF)是由本专利技术人最先克隆成功并命名的细胞因子。功能研究发现，CKLF1具有广谱的趋化活性和增殖刺激活性(参见国际申请PCT/CH00/00026)，而CKLF2是CKLF的全基因产物，编码152个氨基酸。专利技术简述在本专利技术中，本专利技术人进一步公开了CKLF2的功能，并在CKLF2的蛋白和核酸序列基础上，利用NCBI的blastp、blastn及tblast数据库，成功得到了其它8个趋化素样因子超家族成员的新基因，经检索，这8个新基因编码的蛋白质为新序列。下文称为趋化素样因子相关蛋白1-8(chemokine-like factor related protein1-8，CKLF-RP1-8)。新的CKLF-RP1-8及CKLF2共同构成了本专利技术所说的“趋化素样因子超家族”，简称CKLF超家族，其具有骨骼肌刺激活性和免疫调节作用。根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种分离的核苷酸序列，其包含新的具有骨骼肌刺激活性和免疫调节作用的趋化素样因子超家族的核苷酸序列或其片段，所述核苷酸序列可以是DNA或RNA，其中DNA包括cDNA、基因组DNA以及合成的DNA。本专利技术优选一种分离的核苷酸序列，其包含如SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQID NO5、SEQID NO7、SEQ ID NO9、SEQID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15或SEQ ID NO17所示的多核苷酸或其片段。本专利技术还提供了与趋化素样因子超家族的多核苷酸杂交，并且与之具有至少70％同源性的多核苷酸。本专利技术提供含有趋化素样因子超家族的多核苷酸序列的载体。本专利技术提供含有趋化素样因子超家族的载体的宿主细胞，其可以经所述载体转化、转染或转导得到。本专利技术提供了用基因工程手段生产本专利技术趋化素样因子超家族的成熟多肽的方法。根据本专利技术的另一个方面，本专利技术提供了含有趋化素样因子超家族的氨基酸序列。本专利技术还提供了趋化素样因子超家族的的变异体、类似物、衍生物或活性片段。本专利技术还包括对本专利技术趋化素样因子超家族成员的多肽或其片段具有特异性的多克隆和单克隆抗体。本专利技术还提供一种药物组合物，其含有本专利技术的趋化素样因子超家族成员或其活性片段，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。本专利技术提供了一种拮抗剂，其可以抑制或封闭本专利技术的趋化素样因子超家族的或其片段的生物活性。本专利技术提供了一种激活剂，其可以激活本专利技术的趋化素样因子超家族或其片段的生物活性。此外，本专利技术进一步提供本专利技术的趋化素样因子超家族的多核苷酸和多肽在制备治疗肌肉萎缩或其它退行性病变，造血系统和/或免疫系统疾病的药物组合物中的应用。图2显示趋化素样因子超家族成员之间亲源性示意图。图3显示趋化素样因子超家族成员的穿膜区结构示意图。图4显示趋化素样因子超家族成员的染色体定位示意图。图5显示趋化素样因子超家族成员的载体构建示意图。图6A和图6B显示CKLF2引起小鼠肌母细胞系C2C12细胞形态的变化，其中图6AC2C12/pcDB；图6BC2C12/CKLF2，从图中可见，CKLF2促进C2C12细胞肌管形成。图7A-图7D显示四种不同方法研究CKLF2对C2C12细胞的促增殖作用的结果，其中图7A.细胞计数法；图7B.MTT法；图7C.细胞周期研究；图7D.H3掺入实验。图8显示CKLF2促进C2C12细胞特异分子MCK的活性。图9显示CKLF2促进C2C12细胞分化特异转录因子Myogenin表达。其中1C2C12/pcDB诱导分化1天；2C2C12/pcDB诱导分化2天；3C2C12/pcDB诱导分化3天；4C2C12/pcDB诱导分化4天；5C2C12/CKLF2诱导分化1天；6C2C12/CKLF2诱导分化2天；7C2C12/CKLF2诱导分化3天；8C2C12/CKLF2诱导分化4天。附图说明图10A-图10C显示CKLF-RP2的组织表达谱，其中图10A1.分子量标准，2.骨骼肌，3.脑，4.肾脏，5.骨髓，6.肝脏，7.心脏；图10B1.分子量标准，2.前列腺癌，3.肠癌，4.肺腺癌，5.乳腺癌，6.卵巢；图10C1.分子量标准，2.胎儿胸腺，3.胎儿骨骼肌，4.胎脾，5.胎肝，6.胎心。图11显示CKLF-RP2对Hela细胞的促增殖作用。图12A和图12B显示CKLF-RP2对脾细胞的促增殖作用，其中图12ApcDB空载体注射小鼠；图12BpcDB-CKLF-RP2注射小鼠。专利技术详述本专利技术是通过如下技术方案实现的专利技术人在人CKLF2的蛋白和核酸序列基础上，利用生物信息学方法成功克隆了大鼠和小鼠CKLF2序列，它们与人CKLF2有相似的结构和功能。在人和小鼠CKLF2的蛋白和核酸序列基础上，利用蛋白质数据库和人的表达序列标签(Expression Sequence Tag，简称EST)进行数据检索和同源性比较，通过EST Assembly machine(网址为http∥www.tigem.it)进行EST拼接，根据全长cDNA序列设计特异的引物，并选择高表达相应基因的单链cDNA文库进行扩增，成功分离并克隆了其它8个趋化素样因子超家族成员的新基因。经检索，这8个趋化素样因子超家族成员的蛋白质为新序列。根据它们被发现的先后顺序及与CKLF2的亲源性不同，分别被命名为趋化素样因子相关蛋白1-8(CKLF-RP1-8)。新的CKLF-RP1-8及本专利技术人以前公开的CKLF2共同构成了本专利技术所说的“趋化素样因子超家族”。本专利技术的趋化素样因子超家族具有骨骼肌刺激活性和免疫调节作用。CKLF-RP1-8和C本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的多核苷酸序列，所述序列包含选自下列序列的成员： （１）一种编码如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２所示的氨基酸序列的多核苷酸或其片段； （２）一种编码如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４所示的氨基酸序列的多核苷酸或其片段； （３）一种编码如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６所示的氨基酸序列的多核苷酸或其片段； （４）一种编码如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８所示的氨基酸序列的多核苷酸或其片段； （５）一种编码如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０所示的氨基酸序列的多核苷酸或其片段； （６）一种编码如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２所示的氨基酸序列的多核苷酸或其片段； （７）一种编码如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４所示的氨基酸序列的多核苷酸或其片段； （８）一种编码如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６所示的氨基酸序列的多核苷酸或其片段。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：韩文玲，马大龙，丁培国，夏东岚，徐明旭，王露，芮珉，邱晓彦，王应，石爽，刘雅楠，陈英玉，张颖妹，宋泉声，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]