植物中富含丁香基的木质素的遗传工程制造技术

本发明专利技术涉及一种新的ＤＮＡ序列，其编码一种先前未鉴别的木质素生物合成途径的酶，芥子醇脱氢酶（ＳＡＤ），该酶调节植物中丁香基木质素的生物合成。本发明专利技术还提供了将这一新ＳＡＤ基因或其基本相似序列掺入植物基因组以在植物中进行富含丁香基的木质素的遗传工程的方法。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请交叉参考本申请要求2000年4月5日提请的美国临时申请No.60/230,086的优先权，该申请在此并入参考。关于联邦政府赞助的研究或开发的声明本专利技术是在美国能源部能源生物科学计划和美国农业部研究资金第USDA99-35103-7896，USDA0 1-03749和DOE DE-FG02-01ER15179号给予的美国政府支持下完成，美国政府在本专利技术中拥有一定权利。专利技术背景本专利技术涉及一种新的DNA序列，其编码一种先前未鉴别的木质素生物合成途径酶，芥子醇脱氢酶(SAD)，其调节植物中丁香基木质素的生物合成。本专利技术还提供了将此新SAD基因序列或与此SAD基因相似的序列导入植物基因组中以遗传工程化植物中富含丁香基的木质素的方法。木质素，一种复杂的酚聚合物，是大多数木本植物包括被子植物和裸子植物的支持结构的主要部分，所述木本植物是造纸和纤维素产品的纤维首要来源。木质素通常构成木材干重的大约25％，使其成为地球上在纤维素之后第二丰富的有机化合物。木质素提供了木材的硬度，部分由于其对生物化学降解的抗性而使其非常适用。尽管木质素对植物生长和结构具有重要性，但其在基于纤维素的木材/农作物收获后加工生产纤维、化学品和能源生产等方面仍存在问题，因为必须花费很大地将木质素从纤维素中除去或降解。木质素的一些结构成分如愈创木基组分，促进单体交联，提高木质素降解抗性(Sarkanen，1971；Chang和Sarkanen，1973；Chiang和Funaoka，1990)。在被子植物中，木质素由愈创木基和丁香基单木质醇(monolignols)的混合物组成，并可以在比裸子植物木质素相对低能量和化学成本下降解，所述裸子植物木质素几乎全部由愈创木基组分组成(Freudenberg，1965)。如果丁香基木质素可以经遗传掺入裸子植物愈创木基木质素或被子植物中，以提高丁香基木质素含量，估计与其野生型相比这种遗传工程化植物的加工每年的节约仅在美国就在60亿至100亿美元范围。因此，长期以来一直尝试了解丁香基单木质醇(monolignol)的生物合成，以遗传工程化植物使其含有更多的丁香基木质素，从而便于木材/农作物加工(Trotter，1990；Bugos等，1991；Boudet等，1995；Hu等，1999)。尽管已知丁香基木质素得自愈创木基木质素，但只揭示了一部分丁香基单木质醇途径及其编码催化所述途径步骤的酶的基因。这部分单木质醇途径在松柏醛处与愈创木基途径分开，是由分别编码松柏醛5-羟化酶(CAld5H)(Osakabe等，1999)和S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)依赖性5-羟基松柏醛O-甲基转移酶(AldOMT)(LI等，2000)的基因介导，形成芥子醛(见附图说明图1)。然而，芥子醛必须酶促转变为芥子醇，即丁香基单木质醇，以在植物中生物合成丁香基木质素(见图1)。编码这种酶即芥子醇脱氢酶(SAD)的基因，从未被鉴别或克隆，其代表一种丢失基因，该基因在植物的丁香基木质素遗传工程化中是必不可少的。因此，需要鉴别和分离这种关键基因(SAD)，以在植物中遗传增加丁香基单木质醇生物合成及用于包含使用这种关键基因的遗传操纵方法。专利技术概述本专利技术提供了一种分离的完整DNA序列，其编码一种新酶，芥子醇脱氢酶SAD，其是植物中丁香基木质素生物合成所必须的并发挥主要作用。SAD催化芥子醛转化为芥子醇，即丁香基单木质醇。SAD的产生及因此丁香基单木质醇的产生，可以通过供应额外的SAD基因拷贝而提高，或者如果需要，通过将SAD基因或其一部分以反义方向插入植物基因组以使催化芥子醇的SAD数量减少而降低。本专利技术一方面提供了含有提高丁香基木质素的产生及抑制愈创木基木质素的产生的基因的完整裸子植物。因此本专利技术提供了易于在制浆过程中脱木质化的裸子植物物种。本专利技术另一方面提供了生产一种表达盒的方法，所述表达盒可插入裸子植物细胞中以在衍生自所述细胞的裸子植物中诱导丁香基木质素的形成。本专利技术再一方面提供了修饰参与裸子植物物种中木质素生物合成的基因的方法，这样丁香基木质素的产生增加而愈创木基木质素的产生被抑制。本专利技术有利地鉴别、分离和/或克隆了被子植物中与丁香基木质素的产生相关的那些基因。本专利技术还有益地提供了编码被子植物物种芥子醇脱氢酶(SAD)的多核苷酸的鉴别和分离，及这种多核苷酸在改变裸子植物中木质素生物合成中的应用。附图简述图1是产生松柏醇和芥子醇的植物单木质醇途径的示意图。图2示出了SAD多核苷酸DNA序列(SEQ ID NO1)及其相应的SAD氨基酸序列(SEQ ID NO2)，分别示于图2A和图2B。图3是白杨SAD和植物CAD的系统发生分析。图4示出白杨PtCAD和PtSAD的分子鉴定。图5示出重组PtCAD和PtSAD反应的HPLC-UV/MS分析。图6示出PtCAD和PtSAD的抑制动力学。图7示出白杨茎中愈创木基和丁香基木质素的定位。图8示出白杨茎中PtCAld5H和PtSAD蛋白的免疫学定位。图9示出各种植物中CAD和SAD蛋白质的免疫反应性。专利技术详述本专利技术涉及编码芥子醇脱氢酶(SAD)的一种基因，所述酶是丁香基单木质醇生物合成中最后一个关键酶，本专利技术提供了编码所述新酶SAD的分离的完整DNA序列。本专利技术还提供了改变植物中木质素组成即生产富含丁香基的木质素的方法，所述方法通过用所述SAD基因转化植物进行，其中所述基因被表达并导致木质素聚合物的丁香基含量增加。本专利技术对造纸和制浆业尤为有价值，因为含有较高丁香基单体含量的木质素更易于化学脱木质化。目前在脱木质化过程中需要大量的能源和时间。用活性SAD基因转化的木本植物在常规造纸原料脱木质化过程中具有明显优势。相似地，通过插入和表达异源SAD基因改变草类中木质素组成，是提高该草类可消化性的一种独特方法，而且对农场业和农业具有明显的经济利益。本专利技术提供了用于转化植物组织以改变木质素单体组成的基因和DNA构建体。根据本专利技术适于转化的植物包括天然缺乏丁香基木质素的植物或以高愈创木基-丁香基比率累积木质素的那些植物。根据本专利技术也适于转化的植物包括其木质素可以使用降低转基因植物木质素的丁香基含量的反义转化构建体改变的那些植物，如果这种改变是所需的。特别地，适当植物包括但非限于裸子植物，被子植物，草类，豆类，饲料作物等。本说明书中所用术语一般具有在现有技术中，本专利技术文中和在使用其的具体场合中的普通含义。在下文或本说明书的其他段落描述了某些术语，为本领域技术人员提供了阐述本专利技术组合物和方法及怎样使用它们的进一步指导。应意识到可以以一种以上的方式阐述相同的事情。因此，可以使用本文所讨论的一或多个术语的替代术语和同义词，本文讨论的术语均没有任何特殊意义。提供了一些术语的同义词。引用一或多个同义词不除外使用其它的同义词。在本说明书任何之处的举例应用，包括本文举例揭示的任何术语，只是例证性的，而无任何限制本专利技术或任何举例术语的范围和含义之意。同样，本专利技术不限于所述优选的实施方案。如本文所用，“基因”是指表达一种特异蛋白质的一个核酸片段，包括在编码区域或编码序列之前的(5’非编码序列)和之后的(3’非编码序列)调节序列。“天然”基因是指在自然界中发现的具有其自身调节序列的基因。“内源基因”是指通常在基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的芥子醇脱氢酶（ＳＡＤ）基因。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：文森特李C姜，李来庚，
申请(专利权)人：密歇根理工大学管理委员会，
类型：发明
国别省市：US[美国]