本发明专利技术公开了一种对胃蛋白酶抗性提高的纤维素酶E4。本发明专利技术所述的一种定点突变改造的纤维素酶E4是由氨基酸序列为SEQ ID NO.1的来源于褐色热单胞杆菌(Thermonospora fusca)的纤维素酶E4中制造多个氨基酸取代而产生的、对胃蛋白酶抗性更强的纤维素分解酶，所述的氨基酸取代是第691位和第800位的取代。本发明专利技术所述的纤维素酶E4不仅依然对纤维素具有催化功能，而且提高了其对胃蛋白酶的耐受性。
A cellulase E4 and its application to the improvement of pepsin resistance
The present invention discloses a cellulase E4 that improves the resistance to pepsin. Cellulase E4 of a fixed point of the invention is composed of the mutated amino acid sequence from SEQ NO.1 to ID Brown (Thermonospora heat single Bacillus fusca) cellulase E4 manufacturing multiple amino acid substitutions have stronger resistance to pepsin, cellulose decomposing enzyme, the amino acid substitution is a 691st bit and 800th bit substitution. The cellulase E4 described in the present invention not only has a catalytic function on cellulose, but also improves the tolerance to pepsin.
【技术实现步骤摘要】
一种对胃蛋白酶抗性提高的纤维素酶酶E4及其应用
本专利技术涉及一种纤维素酶胃蛋白酶E4，特别是一种对胃蛋白酶抗性提高的纤维素酶E4。
技术介绍
纤维素酶是指能降解纤维素的一类酶的总称，是一个由多种水解酶组成的复杂酶系，主要来自于真菌和细菌。根据各酶功能的不同主要分为三类：(1)葡聚糖内切酶(1,4-β-D-glucanglucanohydrolase，EC.3.2.1.4)，来自于真菌简称为EG；来自于细菌简称成为Len，这类酶一般作用于纤维素内部的非结晶区，随机水解β-1,4糖苷键，将长链纤维素分子截断，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素；(2)葡聚糖外切酶(1,4-β-D-glucancellobihydrolase，EC.3.2.1.91)，来自于真菌简称为Cbh；来自于细菌简称成为Cex，这类酶作用于纤维素线性分子末端，水解β-1,4糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子，故又称为纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase)；(3)β-葡聚糖苷酶(β-1,4-glucosidase，E.C3.2.1.21，简称BG)，这类酶将纤维二糖水解成葡萄糖分子。作为纤维素酶的重要组成部分纤维素酶E4，它是由褐色热单胞菌(Thermomonosporafusca)产生的，T.fusca是一种生存在土壤中的嗜热的丝状放线菌，其产生6种结构和功能各有特点的纤维素酶。包括：两种外切纤维素酶，三种内切纤维素酶，褐色热单胞菌产生的另外一种，也是最为独特的一种纤维素酶为Cel9A(ex-E4)，它同时表现出内切酶和外切酶的共同的活性，具有较高的研究利用价值，因此也是饲用酶制剂中纤维素用酶的首选。我国配合饲料中除一般玉米-豆粕型日粮，还有在玉米-豆粕型日粮基础上加入10％-40％的大麦或小麦、次粉、麦麸、统糠、棉粕等非常规饲料原料，这使得饲料中非淀粉多糖(NSP)和植酸等抗营养因子增多降低了畜禽对饲粮中营养物质的消化、吸收及利用，影响畜禽健康和生产性能。因此饲用酶制剂在饲料工业中占有重要地位。另外，外国低价格小麦、大麦产品的涌入，将进一步刺激饲用酶制剂的市场需求。目前，饲用酶制剂在世界各国广泛应用于猪、家禽、反刍动物、水产动物的饲粮中。随着生物技术的发展，通过微生物发酵方法可大量人工制成各种酶制剂，为其在饲料工业中大规模应用提供了保障。麦类日粮中各种植物性饲料原料都由无数植物细胞构成，细胞的细胞壁包裹着淀粉、蛋白质、脂肪等营养物质。细胞壁主要由纤维素，半纤维素、果胶和木质素等构成，饲料粉碎工序难以破坏细胞壁。单胃动物消化酶液无法消化细胞壁物质，而NSP酶降解细胞壁中的细胞壁物质，使细胞壁崩解，释放出被细胞壁包裹的养分，为动物所利用。作为NSP酶中重要组成部分纤维素酶发挥着重要作用。饲料用酶是在进入养殖动物消化道之后发挥作用的，它本身作为一种具有生物活性的蛋白，其发挥作用受到动物消化道环境的影响，而胃中较低的pH值可能对酶的活性有很大影响，降低了酶制剂的使用效率。因此获得具有蛋白酶抗性的酶制剂很有必要。
技术实现思路
本专利技术的首要目的是提供一种对胃蛋白酶抗性提高的纤维素酶E4。本专利技术是对纤维素酶E4的基因进行定点突变。由褐色热单胞杆菌(Thermonosporafusca)中获得得纤维素酶E4已经被测序。GenBank登录号为L20093.1，长度为2502bp，编码834个氨基酸残基。根据本专利技术所述的一种定点突变改造的纤维素酶E4，是是由氨基酸序列为SEQIDNO.1的来源于褐色热单胞杆菌(Thermonosporafusca)的纤维素酶E4中制造多个氨基酸取代而产生的、对胃蛋白酶抗性更强的纤维素分解酶，所述的氨基酸取代是第691位和第800位的取代。根据本专利技术所述的定点突变改造的纤维素酶E4的进一步特征，所述在第691位的氨基酸取代是用组氨酸取代亮氨酸；在800位的氨基酸取代是用组氨酸取代亮氨酸。本专利技术所述的突变体纤维素酶(命名为mE4L691H,L800H)，经模拟胃液(pH＝1.2，3.2mg/mL胃蛋白酶溶液)处理1h后，其半衰期比野生型酶延长了83min，其对胃蛋白酶的抗性比野生型E4提高5.88倍，因此该酶蛋白不仅依然对纤维素具有催化功能，而且提高了其对胃蛋白酶的耐受性，其他酶学性质与野生型酶基本一致，仅在数值表征上稍逊。进一步地，本专利技术提供了一种DNA分子，其编码本专利技术所述的对胃蛋白酶抗性提高的纤维素酶。优选地，本专利技术所述的DNA分子的核苷酸序列为SEQIDNO.3。本专利技术的另一个目的是提供一种载体，其含有本专利技术所述的DNA分子。本专利技术的又一个目的是提供一种宿主细胞，其含有本专利技术所述的DNA分子，或者含有本专利技术所述的载体。上述载体和宿主细胞都可以通过本领域公知的技术手段进行制备。本专利技术还提供了本专利技术所述的对胃蛋白酶抗性提高的纤维素酶E4的生产方法，包括在适于E4表达的条件下培养本专利技术所述的宿主细胞，并从培养基中分离所述的纤维素酶E4。当本专利技术所述的DNA分子以合适的取向和正确的阅读框插入到所述的载体，或者转入所述的宿主细胞中，所述的DNA分子可以在任何真核或者原核表达系统中表达。许多宿主-载体系统都可以用来表达蛋白质编码序列。宿主-载体系统包括但不限于：用噬菌体、质粒或粘粒转化的细菌；含有酵母载体的微生物，如酵母；用病毒感染的哺乳动物细胞系统；用病毒感染的昆虫细胞系统；用细菌感染的植物细胞系统。本专利技术优选的载体包括病毒载体、质粒、粘粒或者寡核苷酸。本专利技术优选的宿主为原核系统如大肠杆菌；本专利技术优选的蛋白质表达方法为低温IPTG诱导分泌表达。由于可用于制备饲料或食品，结合目前的饲料和食品的加工工艺，本专利技术进一步提供了所述的定点突变改造的纤维素酶E4在制备饲料或食品或其添加剂中的应用。附图说明图1和图2分别显示本专利技术所述的野生型E4蛋白与突变体在经胃蛋白酶处理后不同时间点的SDS-PAGE鉴定结果。目的蛋白条带的大小为100Kd左右。图3是本专利技术所述的灰度扫描结果算出的蛋白残留率。图4是由公式c＝c0e-kt得到的图。具体实施方式本文中所采用的术语，除非另有说明，均为本领域技术人员所通常理解的含义。以下提供在本专利技术中使用的一些特殊术语的定义。“wtE4”表示野生型纤维素酶E4，其基因以斜体wtE4表示。“mE4L691H,L800H”表示突变体纤维素酶E4，其基因以mE4L691H,L800H表示。实施例1：全基因合成wtE4，mE4L691H,L800H基因本专利技术委托华大基因公司利用全基因合成手段获取了来源于Thermonosporafusca的纤维素酶E4基因(L20093.1)和突变体mE4L691H,L800H，其载体为PET28a+，含Kan抗性。宿主菌为TOP10。实施例2：含目的基因的PET28+质粒转化BL21(DE3)1、利用质粒抽提试剂盒抽提含目的基因的PET28+质粒(1)柱平衡步骤：向吸附柱CP4中(吸附柱放入收集管中)加入600ul的平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。(2)取5ml过夜培养的菌液加入离心管中，12,000rpm离心1min，尽量吸除上清。(3)向留有菌体沉淀的离心管中加入250ul溶液P1(已加入RNas本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种对胃蛋白酶抗性提高的纤维素酶E4，其特征在于：它是由氨基酸序列为SEQ ID NO.1的来源于褐色热单胞杆菌(Thermonospora fusca)的纤维素酶E4中制造多个氨基酸取代而产生的、对胃蛋白酶抗性更强的纤维素分解酶，所述的氨基酸取代是第691位和第800位的取代。
【技术特征摘要】
1.一种对胃蛋白酶抗性提高的纤维素酶E4，其特征在于：它是由氨基酸序列为SEQIDNO.1的来源于褐色热单胞杆菌(Thermonosporafusca)的纤维素酶E4中制造多个氨基酸取代而产生的、对胃蛋白酶抗性更强的纤维素分解酶，所述的氨基酸取代是第691位和第800位的取代。2.根据权利要求1所述的对胃蛋白酶抗性提高的纤维素酶E4，其特征在于：所述在第691位的氨基酸取代是用亮氨酸取代组氨酸；在800位的氨基酸取代是用亮氨酸取代组氨酸氨酸；所述纤维素酶E4突变体的氨基酸序列为SEQIDNO.2。3.一种DNA分子，其特征在于：其编码权利要求2所述的对...
【专利技术属性】
技术研发人员：姚冬生，王英，谢春芳，刘大岭，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44
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