一种妥布霉素的纯化方法技术

本发明专利技术涉及一种妥布霉素的纯化方法，该方法采用纳滤结晶方式对经过水解、脱色、膜过滤后的妥布霉素溶液进行处理，然后对结晶得到的晶体采用制备色谱柱进行柱层析分离，采用此种方法得到的妥布霉素的HPLC纯度达99.4％以上，且采用纳滤结晶方式，避免了现有技术中结晶前的多次离子交换操作，具有操作简便，生产成本低的优势；采用制备柱层析分离的方式不仅提高了产品收率和品质，还减少了生产时间，降低了废液量，减少了环境污染。

A method for purifying tobramycin

The invention relates to a purification method of tobramycin, the method of using nanofiltration crystallization after tobramycin solution hydrolysis and decolorization and membrane filtration process, preparation of chromatographic column by column chromatography and crystallization of the crystals were obtained by using this method, tobramycin to HPLC purity was more than 99.4%, and the use of nanofiltration crystal, avoid multiple ions in the prior art crystallization before the exchange operation, has the advantages of simple operation, low production cost advantages; preparation of chromatographic separation by way of system not only improves the product yield and quality, but also reduce the production time, reduce waste, reduce environmental pollution.

【技术实现步骤摘要】
一种妥布霉素的纯化方法
本专利技术涉及生物发酵制药领域，尤其涉及一种妥布霉素的纯化方法。
技术介绍
妥布霉素(结构如下所示)，是一种氨基糖苷类抗生素，临床主要用于敏感细菌引起的严重感染，如革兰阴性菌特别是绿脓杆菌、大肠杆菌及肺炎杆菌等引起的烧伤感染、败血症、呼吸系统感染、泌尿系统感染、胆囊胆道感染及软组织严重感染等。妥布霉素的抗菌活性与庆大霉素相似，对多数革兰阴性杆菌及绿脓杆菌有良好作用，对葡萄球菌属不产酶株的MIC。虽然国内有专利(CN201310621366.6)和论文发表，构建了新的工程菌，能够发酵直接生成妥布霉素，避免了从氨甲酰妥布霉素水解，但是国内绝大部分厂家还是通过黑暗链霉菌发酵生产氨甲酰妥布霉素，再通过水解得到妥布霉素的工艺为主。如下所示时生产妥布霉素的经典流程：这种发酵方式得到的产物含量较低，杂质水平比较高，特别是安普霉素和氨基酰卡拉霉素B两种杂质(结构如下)，和产品结构非常相近，分离难度很大。所以目前的工艺，在上述经典工艺“711树脂脱色”后往往还要1-2次的离子交换树脂进行色谱分离，才能得到90％以上含量的妥布霉素。为了保证分离效果，生产整个层析过程时间非常长，以生产2m直径，4米高的层析柱来说，大致需要20-30天才能完成一个批次的生产。此外收率不高，妥布霉素90％以上含量的收率不到60％，95％以上含量的收率更低。此外，妥布霉素的结晶比较困难，非常容易形成胶体，所以为了保证结晶的效果，大部分结晶采用的是90％以上高纯的妥布霉素进行的，这就决定了发酵生产的妥布霉素必须要进行多次离子交换层析纯化后才能结晶。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术存在的缺陷，提供一种操作简便，纯化得到的妥布霉素纯度高的妥布霉素纯化方法。为了实现上述目的，具体采用如下技术方案：(1)将妥布霉素粗品溶于水中，得粗品水溶液；向所述粗品水溶液中加入甲醇或乙醇，得混合液；(2)使所述混合液透过水平设置的纳滤膜，观察到晶体析出后，停止纳滤，静置析晶；(3)对步骤(2)析出的晶体进行制备色谱分离，以0.5％～1.5％的三氟乙酸水溶液为流动A相，甲醇为流动B相，按照体积比为10-100:0-90的A和B的混合液为流动相进行梯度洗脱，收集富含妥布霉素的流出液，即得。其中，步骤(1)中，所述粗品水溶液中妥布霉素的浓度为300-350g/L，所述甲醇或乙醇的加入量为所述粗品水溶液体积的4-5倍。本专利技术所述的妥布霉素粗品可以为固体粗品，也可为含有妥布霉素的液体粗品。当所述粗品为液体时，可采用常用的稀释或浓缩的手段将溶液中妥布霉素的浓度调节至300-350g/L，然后再加入甲醇或乙醇制备混合液，此种浓度的混合液有助于后续的纳滤结晶操作中晶体的缓慢析出，且得到的晶体纯度好，收率高。优选地，所述粗品水溶液通过如下方法得到：采用阳离子交换树脂吸附法从生产氨基甲酰胺妥布霉素的发酵液中提取氨基甲酰胺妥布霉素，水解所述氨基甲酰胺妥布霉素，对所得水解液进行脱色、膜过滤处理后，即得。其中，所述的氨基甲酰胺妥布霉素发酵液为本领域技术人员知晓的由黑暗链霉菌发酵产生。所述的阳离子交换吸附，水解，脱色，膜过滤操作均与现有技术中纯化妥布霉素的前期操作相似(具体可见
技术介绍
中提及的经典操作)，可按照现有技术的条件进行处理。具体而言，所述阳离子交换树脂吸附法以732阳离子交换树脂为固定相，以1-3％的氨水为解吸剂(优选2％的氨水)。所述水解的条件为：80-90℃，pH为9.5～10，水解2-3小时。所述脱色采用711树脂。所述膜过滤采用孔径80-150道尔顿的纳滤膜。在一种具体的实施方式中，所述粗品水溶液是通过如下方法得到的：发酵液放罐，通过压滤得到含有氨甲酰妥布霉素的滤液，采用732阳离子交换树脂对所得滤液进行吸附，然后用1-3％的氨水进行解吸，解吸液于80-90℃，pH为9.5～10的条件下水解得到妥布霉素溶液；使用711树脂对所述妥布霉素溶液进行脱色，得到的脱色液采用孔径为80-150道尔顿的卷式纳滤膜机进行浓缩，控制浓度为300-350g/L，即得。其中，步骤(2)采用纳滤法对步骤(1)得到的混合液进行结晶处理，使混合液缓慢透过水平设置的纳滤膜，利用水比有机溶剂更容易透过纳滤膜的特性，缓慢改变结晶体系中水和有机溶剂的比例，使得妥布霉素顺利结晶出来。此种方法提高了妥布霉素的含量，同时避免了现有技术中在结晶前需要多次离子交换层析处理的麻烦，大大简化了操作，降低了生产成本。专利技术人研究发现，纳滤膜的孔径对步骤(2)的析晶有较大影响，当纳滤膜孔径较大时，目标化合物(妥布霉素)能够透过纳滤膜，造成收率降低；当膜孔径较小时，纳滤操作缓慢，效率低下。因此，本专利技术优选地，步骤(2)中，所述纳滤采用孔径100-200道尔顿的纳滤膜，此时既可以保证纳滤操作时透过液的速度不至于太慢，又能保证产品不会过多的透过膜，造成收率损失。进一步优选地，所述纳滤在1.2-1.5MPa压力下进行。优选地，步骤(2)中，还包括观察到晶体析出后，继续纳滤直至所述混合液体积减少至相当于所述混合液体积的0.5-1倍，再停止纳滤的步骤。专利技术人经研究发现，在此种条件下进行结晶，既能最大程度的除去溶液中的水分，使结晶更充分，又不至于结晶过度，造成纯度的降低。本专利技术同时提供了一种便于步骤(2)纳滤操作的杯式纳滤机，所述杯式纳滤机包括敞口的桶体，和覆盖在所述敞口上的桶盖，所述桶体和桶盖形成一个密闭的空间；所述桶体内设置有与所述桶体的横截面相平行的纳滤膜，所述纳滤膜、桶盖以及二者之间的桶壁形成用于盛放待纳滤液体的料液槽，所述纳滤膜、桶底以及二者之间的桶壁形成废液收集槽；所述桶盖上设置有伸入所述料液槽内的搅拌桨、观察视窗、压力表和阀门。所述杯式纳滤机由不锈钢材质制成，能够承受2Mpa以上的压力。在优选的实施方式中，所述纳滤膜的下部还设置有一个支承层，所述支承层的中间设有微孔，上方纳滤膜透过液通过微孔进入到废液收集槽中。在另一优选的实施方式中，所述料液槽的外侧设置有用于对所述纳滤液体加热或降温的夹套。采用此杯式纳滤机进行纳滤操作的方法为：(1)将步骤(1)的混合液转移至料液槽中；(2)盖上桶盖形成一个密闭空间；(3)启动料液桶盖上的搅拌装置，搅拌速率为50-120转/分钟；(4)通过桶盖上的阀门，向桶体内通入压缩氮气，气压维持在1.2-1.5Mpa。(5)通过视窗观察，当料液中有明显的晶体析出后，继续纳滤至料液槽内的溶液体积为混合液体积的0.5-1倍，停止纳滤，将桶内压力缓慢降低到常压，搅拌到结晶结束后，料液转入分离设备分离，收集晶体，备用。本专利技术的纳滤操作适宜采用水平设置的纳滤膜，此种情况下，晶体能够缓慢析出，确保结晶的顺利进行，采用市售的管式纳滤膜或卷式纳滤膜进行本专利技术的纳滤操作，效果较差。其中，步骤(3)中所述的C18键合硅胶可市购获得，本专利技术优选采用华普新创生产的XAquaC18填料，粒径10-12μm。优选地，步骤(3)中，流动A相为1％的三氟乙酸水溶液。优选地，步骤(3)中，所述制备色谱以C18键合硅胶为固定相，按照0-10min100％A，10-20minA：B＝(10-30):(70-90)的梯度进行洗脱。进一步优选地，梯度洗脱条件为：0-10min100％A，10-20minA：B＝本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种妥布霉素的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将妥布霉素粗品溶于水中，得粗品水溶液；向所述粗品水溶液中加入甲醇或乙醇，得混合液；(2)使所述混合液透过水平设置的纳滤膜，观察到晶体析出后，停止纳滤，静置析晶；(3)对步骤(2)析出的晶体进行制备色谱分离，以0.5％～1.5％的三氟乙酸水溶液为流动A相，甲醇为流动B相，按照体积比为10‑100:0‑90的A和B的混合液为流动相进行梯度洗脱，收集富含妥布霉素的流出液，即得。

【技术特征摘要】
1.一种妥布霉素的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将妥布霉素粗品溶于水中，得粗品水溶液；向所述粗品水溶液中加入甲醇或乙醇，得混合液；(2)使所述混合液透过水平设置的纳滤膜，观察到晶体析出后，停止纳滤，静置析晶；(3)对步骤(2)析出的晶体进行制备色谱分离，以0.5％～1.5％的三氟乙酸水溶液为流动A相，甲醇为流动B相，按照体积比为10-100:0-90的A和B的混合液为流动相进行梯度洗脱，收集富含妥布霉素的流出液，即得。2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：所述粗品水溶液中妥布霉素的浓度为300-350g/L，所述甲醇或乙醇的加入量为所述粗品水溶液体积的4-5倍。3.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其特征在于：所述粗品水溶液通过如下方法得到：采用阳离子交换树脂吸附法从生产氨基甲酰胺妥布霉素的发酵液中提取氨基甲酰胺妥布霉素，水解所述氨基甲酰胺妥布霉素，对所得水解液进行脱色、膜过滤处理后，即得。4.根据权利要求3所述的纯化方法，其特征在于：所述阳离子交换树脂吸附法以732阳离子交换树脂为固定相，以1-3％的氨水为解吸剂；和/或，所述水解在80-90℃，pH为9.5～10的条件下进行；和/或，所述脱色采用711树脂；和/或，所述膜过滤采用孔径80-150道尔顿的纳滤膜。5.根据权利要求1或2或4所述的纯化方法，其特征在于：步骤(2)中，还包括观察到晶体析出后，继续纳滤直至所述混合液体积减少至相当于所述粗品水溶液体积的0.5-1倍，再停止纳滤的步骤。6.根据权利要求5所述的纯化方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：何勇崴，岳光，张葵，
申请(专利权)人：北大方正集团有限公司，北大医药重庆大新药业股份有限公司，北大医疗产业集团有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11