来源于稻的高表达型多肽链延长因子启动子及其使用方法技术

本发明专利技术提供具有在植物组织（特别是细胞增殖旺盛的组织）中强烈表达异种基因的启动子活性的ＤＮＡ。该ＤＮＡ为序列号１所示序列或具有其一部分的序列，其具有与序列号１的序列同等的启动子活性，为稻ＯｓＥＦ１　　β　　１基因启动子。还提供包含与该启动子可表达地连接的异种基因的表达载体。还提供由此表达载体性状转化的植物细胞、由此植物细胞再生的植物体、该植物体的后代和传播体以及由其后代得到的种子。还提供使用表达载体将基因导入植物中的方法。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及有用植物的育种，其中使用植物基因的启动子。更详细地说，涉及有用植物的育种，其中使用稻的多肽链延长因子β1(以下称为OsEF1β1)基因的启动子。
技术介绍
近年来，为了赋予植物所需的性质，一般是在植物中导入所需的基因，使之表达。但是，这种表达在植物的生长和发育阶段会发生变化，例如虽然在植物幼小时期进行表达，但是随着不断生长和发育，有时表达会减弱。因此，需要一种启动子，其能够稳定地表达导入的基因，而与植物的生长和发育阶段无关。多肽链延长因子是与核糖体中的氨基酸聚合反应有关的因子，在进行蛋白质合成的细胞中进行表达。在Arabidopsis thaliana中构筑使多肽链延长因子1β(eEF-1β)的启动子区域和5’末端区域以及β-葡萄糖醛酸酶(GUS)基因融合的嵌合基因，使用其考察转基因植物中该基因的表达(Gene，170，(1996)201-206)。发现该基因的第1内含子必须高水平表达。该试验表明Arabidopsis thaliana的eEF-1β的第1内含子中可以存在增强子样的元件。关于稻的多肽链延长因子的研究，在FEBS Letters 311(1992)46-48；FEBS Letters 338(1994)103-106；以及Biochemica etBiophysica Acta 1442(1998)369-372中有报道。FEBS Letters 311(1992)46-48报道了编码稻多肽链延长因子1β’(EF-1β’)的cDNA的克隆和分离，FEBS Letters 338(1994)103-106报道了编码稻多肽链延长因子1β(EF-1β)的cDNA的克隆和分离，而且Biochemicaet Biophysica Acta 1442(1998)369-372报道了稻多肽链延长因子1β(EF-1β)形成的多基因家族的新型基因EF-1β2的分离和特征。但是，任何一篇文献都仅仅与多肽延长因子家族的其它成员进行了序列比较，而没有提到启动子活性。因此，如果能够由稻的基因取得一种用于表达的启动子，该启动子与植物的生长和发育阶段无关，持久，且活性高，能够实际使用，那么将会对包括稻等作物在内的有用植物的品种改良做出巨大贡献。专利技术公开本专利技术涉及利用基因工程学方法的植物育种，其目的在于提供一种强烈促进在植物组织中表达的植物基因启动子，及含有该启动子的表达载体，以及其利用方法。本专利技术人发现稻的多肽链延长因子基因(OsEF1β1)持久地显示非常高的启动子活性，基于这一发现完成了本专利技术。本专利技术提供一种DNA，其具有在植物组织中使异种基因强烈表达的启动子活性。该DNA是具有序列号1(图2A～C)表示的序列或其一部分，且具有与序列号1的序列同等的启动子活性的DNA。其中，序列号1表示的序列包括稻OsEF1β1结构基因的5’上游区域、第1外显子、第1内含子和第2外显子的一部分。在本专利技术的1种实施方式中，本专利技术的启动子能够在生长分裂组织中特异地促进异种基因的表达。在本专利技术的一种实施方式中，该DNA在严紧条件下，与具有序列号1记载的序列或其一部分的多核苷酸杂交。本专利技术还提供一种用于在植物组织中使异种基因强烈表达的表达载体。该表达载体包括稻OsEF1β1基因启动子，其具有序列号1表示的序列或其一部分，且具有与序列号1的序列同等的启动子活性，而且该表达载体还包括与该启动子能够表达地连结的异种基因。本专利技术还提供通过上述表达载体进行性状转化得到的植物细胞(可以是单子叶植物细胞或双子叶植物细胞)、由该植物细胞再生的植物体、该植物体的后代及传播体、以及由该后代得到的种子。本专利技术还提供在植物中导入希望在植物组织中表达的异种基因的方法。该方法包括下述步骤用上述表达载体使植物细胞进行性状转化的步骤，以及使进行了这种性状转化的植物细胞进行再分化，得到植物体的步骤。在上述方法中，植物细胞可以是单子叶植物细胞或双子叶植物细胞中任意一种。附图说明图1表示λOsEF1β1插入片段的限制图。图2A～C是表示OsEF1β1的5’末端区域的序列的图。图中，“n”表示A、T、C或G。图中，大写字母对应的碱基表示外显子部位(1671位～1876位以及2639位～2651位)。图3是表示OsEF1β1GUS融合构建物的模式图。图4是表示本专利技术的性状转化植物以及用含有35S启动子作为启动子的载体进行性状转化得到的对照植物中各组织的GUS组织染色结果的照片。专利技术的最佳实施方式以下更详细地说明本专利技术。(稻OsEF1β1基因启动子的分离)稻OsEF1β1基因启动子由稻的基因组文库筛选得到。可以使用美国CLONTECH公司(CLONTECH Laboratories Inc.，Palo Alto，CA)市售的稻基因组DNA文库(Rice Genomic Library)。作为筛选用的探针，可以使用本专利技术人分离得到的稻OsEF1β1cDNA。首先，使大肠杆菌感染用噬菌体λ制作的稻基因组基因文库，形成噬斑。按照常规方法将该噬斑移至硝酸纤维素等的膜上，用标记后的筛选用探针进行杂交。杂交结束后，洗涤，进行放射自显影，由确认杂交的噬菌体制备DNA。组合适当的限制酶对制备的噬菌体DNA进行消化，通过凝胶电泳分离其消化产物。将分离的DNA片段移至尼龙薄膜上，使之杂交上述筛选用探针，根据信号强度和谱带图案的差异进行筛选。认为信号最强的无性系含有OsEF1β1基因，信号弱的无性系含有的基因与OsEF1β1类似，但不是OsEF1β1。另外，通过谱带图案的比较，能够识别缺失部分基因的无性系。而且，通过制作以谱带图案为基础的各种无性系的物理地图，可以确定推测构成启动子的结构基因5’上游的长度为约1.6Kbp左右的无性系。如上所述，分离得到完全的OsEF1β1基因组基因。通过比较OsEF1β1基因组基因的碱基序列和OsEF1β1 cDNA的碱基序列，可以确定启动子区域。作为启动子序列，基因组基因具有内含子时，不仅可以含有结构基因的5’上游区域，也可以含有第1内含子等区域。本启动子序列优选序列号1表示的序列(也参照图2A～C；序列号1和图2表示的序列中，“n”表示腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)和胞苷(C)中任意一种)。序列号表示的序列包括稻OsEF1β1结构基因的5’上游、第1外显子、第1内含子和第2外显子。(通过GUS活性测定确定启动子活性部分)如果能够确定OsEF1β1基因的启动子区域，则可以切出其序列，连结到植物表达用载体中。为了评价连结的启动子的活性，可以制作在该启动子的下游连结了报道基因例如编码适当酶的基因的质粒。将该质粒引入到植物细胞中，测定、观察基因的表达，例如酶活性。以植物作为宿主的场合，一般例如使用pBI101等质粒，以β-葡萄糖醛酸酶(GUS)的表达作为指标进行测定，在本说明书中，也可以适用通过GUS的表达进行测定的方法。GUS活性采用例如植物细胞工学，第4卷，第4号，281～286页(1992)，植物细胞工学，第5卷，第5号，407～413页(1992)，Plant Mole.Biol.Reporter 5(4)387-405(1987)记载的顺序进行测定，但测定方法并不限于此。简单而言，将植物体的各组织或切片浸渍于含有1mM 本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有在植物中强烈表达异种基因的启动子活性的ＤＮＡ，其中，是具有序列号１所示的序列或其一部分的序列，且具有与序列号１的序列同等的启动子活性。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：田中宥司，番保德，萱野晓明，松冈信，坂本知昭，
申请(专利权)人：独立行政法人农业生物资源研究所，
类型：发明
国别省市：JP[日本]