枯草杆菌酶变体制造技术

本发明专利技术涉及在一种或多种特性上与亲本枯草杆菌酶不同的新枯草杆菌酶变体，所述特性包括：洗涤性能、热稳定性、储藏稳定性或催化活性。本发明专利技术的变体适用于例如清洁或洗涤剂组合物，如洗衣洗涤剂组合物和洗盘组合物，包括自动洗盘组合物中。所述变体在氨基酸序列的５２个指定位置之至少一个位置处包含缺失、替换或插入。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及在一种或多种特性上与亲本枯草杆菌酶不同的新枯草杆菌酶(subtilase)变体，所述特性包括洗涤性能、热稳定性、储藏稳定性或催化活性。本专利技术的变体适用于，例如，清洁或洗涤剂组合物，如洗衣洗涤剂组合物和洗盘组合物，包括自动洗盘组合物中。本专利技术还涉及编码该变体的分离的DNA序列、表达载体、宿主细胞，以及产生和使用本专利技术变体的方法。而且，本专利技术涉及包含本专利技术变体的清洁和洗涤剂组合物。
技术介绍
在洗涤剂工业中，酶已在洗涤制剂中使用了30年以上。用于这些制剂的酶包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶和其它酶或它们的混合物。商业上最为重要的酶是蛋白酶。数量不断增长的商用蛋白酶是天然存在的野生型蛋白酶的蛋白质工程化变体，如DURAZYM(Novo Nordisk A/S)、RELASE(Novo NordiskA/S)、MAXAPEM(Gist-Brocades N.V.)、PURAFECT(GenencorInternational，Inc.)。而且，本领域描述了许多蛋白酶变体。WO 99/27082中给出了现有技术中蛋白酶变体的完整列表。虽然已描述了大量有用的蛋白酶变体，但是对于许多工业应用，例如洗衣或硬表面清洁而言，仍需要新的改进的蛋白酶或蛋白酶变体。因此，本专利技术的一个目的是提供改进的枯草杆菌酶变体用于此类目的。专利技术概述因此，在第一方面，本专利技术涉及包含至少一个或多个如下改变的枯草杆菌酶变体 X11{A，R，N，D，C，Q，E，G，H，I，L，K，M，F，S，T，W，Y，V}，缺失，插入；X30{A，R，N，D，C，Q，E，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V}，缺失，插入；X31{R，N，D，Q，E，H，K，M，P，W，Y}，缺失，插入；X32{A，R，D，C，E，G，H，I，L，K，M，F，P，T，W，Y，V}，插入；X34{A，R，N，D，C，Q，E，G，H，I，L，K，M，F，S，T，W，Y，V}，缺失；X65{A，R，C，G，H，I，L，K，M，F，T，W，Y，V}，缺失，插入；X66{A，R，C，H，I，L，K，M，F，T，W，Y，V}，缺失，插入；X67{A，R，N，Q，G，H，I，K，M，F，P，S，T，W，Y，V}；X68{R，N，D，Q，E，G，H，I，L，K，F，P，S，T，W，Y，V}，缺失，插入；X69{A，R，N，D，Q，E，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V}，缺失，插入；X70G；X71T；X77N；X83G，插入；X84V；X85{A，R，N，D，Q，E，G，H，I，L，M，F，S，T，W，Y，V}；X90{A，R，N，D，C，Q，E，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V}，缺失，插入；X95{R，K，F，W，Y，V}，缺失；X107IX110G，插入；X121V，插入；X122插入；X123N；X125S；X150{A，R，N，D，Q，E，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V}，缺失，插入；X152{A，R，N，D，Q，E，H，K，F，P，W，Y，V}；X153{R，N，D，Q，E，G，H，I，L，K，M，F，T，W，Y，V}；X154{A，R，G，H，I，L，M，F，W，Y，V}； X164{A，R，H，T，W}；X165{R，L，F，W，Y}；X166{W，Y}，插入；X175{R，N，D，Q，E，G，H，K，M，F，P，T，W，Y，V}；X177{R，N，D，Q，E，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V}，缺失，插入；X178{A，R，N，D，C，Q，E，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V}，缺失，插入；X180{A，R，N，D，C，Q，E，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V}，缺失，插入；X199{R，L，K，F，W，Y，V}，缺失，插入；X200{A，R，I，L，K，M，F，W，Y，V}，缺失，插入；X201{A，R，H，I，L，K，M，F，P，T，W，Y，V}，缺失，插入；X202{A，R，C，G，H，I，L，K，M，F，T，W，Y，V}；X207{A，R，N，C，Q，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V}；X220T，插入；X223A，插入；X225P，插入；X226H，插入；X227V，插入；X228A，插入；X229G，插入；X230插入；X231A，插入；X253{A，R，N，D，Q，E，G，H，I，L，M，F，S，T，W，Y，V}，缺失，插入；X264{A，R，N，Q，G，H，I，L，M，F，S，T，W，Y，V}，缺失，插入；X266{A，R，N，D，C，Q，E，G，H，I，L，K，M，F，S，T，W，Y，V}，缺失，插入；其中，(a)所述改变各自独立地为(i)以不同的氨基酸替换占据所述位置的氨基酸， (ii)缺失占据所述位置的氨基酸，或(iii)在占据所述位置的氨基酸的下游插入至少一个额外氨基酸，(b)所述变体具有蛋白酶活性，且(c)每个位置都对应于附图说明图1所示枯草杆菌蛋白酶BPN’氨基酸序列的位置。第二方面，本专利技术涉及编码本专利技术枯草杆菌酶变体的分离的多核苷酸。第三方面，本专利技术涉及包含本专利技术的分离多核苷酸的表达载体。第四方面，本专利技术涉及用本专利技术的表达载体转化的微生物宿主细胞。第五方面，本专利技术涉及用于产生本专利技术枯草杆菌酶变体的方法，其中在有利于该变体表达和分泌的条件下培养本专利技术的宿主，并回收该变体。第六方面，本专利技术涉及包含本专利技术变体的清洁或洗涤剂组合物，优选地洗衣或洗盘组合物。关于序列比对和编号参考图1，该图显示在枯草杆菌蛋白酶BPN′(a)(BASBPN)和枯草杆菌蛋白酶309(BLSAVI)(b)之间的序列比对。在本专利申请中此序列比对(alignment)用作对残基进行编号的参照。定义在更详细地讨论本专利技术之前，首先定义以下的术语和约定。氨基酸命名法A＝Ala ＝ 丙氨酸V＝Val ＝ 缬氨酸L＝Leu ＝ 亮氨酸I＝Ile ＝ 异亮氨酸P＝Pro ＝ 脯氨酸 F＝ Phe ＝ 苯丙氨酸W＝ Trp ＝ 色氨酸M＝ Met ＝ 甲硫氨酸G＝ Gly ＝ 甘氨酸S＝ Ser ＝ 丝氨酸T＝ Thr ＝ 苏氨酸C＝ Cys ＝ 半胱氨酸Y＝ Tyr ＝ 酪氨酸N＝ Asn ＝ 天冬酰胺Q＝ Gln ＝ 谷氨酰胺D＝ Asp ＝ 天冬氨酸E＝ Glu ＝ 谷氨酸K＝ Lys ＝ 赖氨酸R＝ Arg ＝ 精氨酸H＝ His ＝ 组氨酸X＝ Xaa ＝ 任何氨基酸核酸命名法A＝ 腺嘌呤G＝ 鸟嘌呤C＝ 胞嘧啶T＝ 胸腺嘧啶(仅在DNA中)U＝ 尿嘧啶(仅在RNA中)变体名称的命名法和约定在描述本专利技术产生的或考虑的多种枯草杆菌酶变体时，采用以下的命名法和约定以易于参照首先通过将分离的酶或亲本酶与枯草杆菌蛋白酶BPN′(BASBPN)比对来定义参考框。可以由GCG软件包9.1版的GAP程序对变体进行编号而获得序列比对，其间使用了以下参数缺口(gap)创建罚分＝8，缺口延伸罚分本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含至少一个或多个如下改变的枯草杆菌酶变体：　　　　Ｘ１１｛Ａ，Ｒ，Ｎ，Ｄ，Ｃ，Ｑ，Ｅ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｋ，Ｍ，Ｆ，Ｓ，Ｔ，Ｗ，Ｙ，Ｖ｝，缺失，插入；　　　　Ｘ３０｛Ａ，Ｒ，Ｎ，Ｄ，Ｃ，Ｑ，Ｅ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｋ，Ｍ，Ｆ，Ｐ，Ｓ，Ｔ，Ｗ，Ｙ，Ｖ｝，缺失，插入；　　　　　Ｘ３１｛Ｒ，Ｎ，Ｄ，Ｑ，Ｅ，Ｈ，Ｋ，Ｍ，Ｐ，Ｗ，Ｙ｝，缺失，插入；　　　　Ｘ３２｛Ａ，Ｒ，Ｄ，Ｃ，Ｅ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｋ，Ｍ，Ｆ，Ｐ，Ｔ，Ｗ，Ｙ，Ｖ｝，插入；　　　　Ｘ３４｛Ａ，Ｒ，Ｎ，Ｄ，Ｃ，Ｑ，Ｅ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｋ，Ｍ，Ｆ，Ｓ，Ｔ，Ｗ，Ｙ，Ｖ｝，缺失；　　　　Ｘ６５｛Ａ，Ｒ，Ｃ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｋ，Ｍ，Ｆ，Ｔ，Ｗ，Ｙ，Ｖ｝，缺失，插入；　　　　　Ｘ６６｛Ａ，Ｒ，Ｃ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｋ，Ｍ，Ｆ，Ｔ，Ｗ，Ｙ，Ｖ｝，缺失，插入；　　　　Ｘ６７｛Ａ，Ｒ，Ｎ，Ｑ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｍ，Ｆ，Ｐ，Ｓ，Ｔ，Ｗ，Ｙ，Ｖ｝；　　　　Ｘ６８｛Ｒ，Ｎ，Ｄ，Ｑ，Ｅ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｋ，Ｆ，Ｐ，Ｓ，Ｔ，Ｗ，Ｙ，Ｖ｝，缺失，插入；　　　　Ｘ６９｛Ａ，Ｒ，Ｎ，Ｄ，Ｑ，Ｅ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｋ，Ｍ，Ｆ，Ｐ，Ｓ，Ｔ，Ｗ，Ｙ，Ｖ｝，缺失，插入；　　　　Ｘ７０Ｇ；　　　　Ｘ７１Ｔ；　　　　Ｘ７７Ｎ；　　　　Ｘ８３Ｇ，插入；　　　　Ｘ８４Ｖ；　　　　Ｘ８５｛Ａ，Ｒ，Ｎ，Ｄ，Ｑ，Ｅ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｍ，Ｆ，Ｓ，Ｔ，Ｗ，Ｙ，Ｖ｝；　　　　Ｘ９０｛Ａ，Ｒ，Ｎ，Ｄ，Ｃ，Ｑ，Ｅ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｋ，Ｍ，Ｆ，Ｐ，Ｓ，Ｔ，Ｗ，Ｙ，Ｖ｝，缺失，插入；　　　　Ｘ９５｛Ｒ，Ｋ，Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｖ｝，缺失；　　　　Ｘ１０７Ｉ　　　　Ｘ１１０Ｇ，插入；　　　　Ｘ１２１Ｖ，插入；　　　　Ｘ１２２插入；　　　　Ｘ１２３Ｎ；　　　　Ｘ１２５Ｓ；　　　　Ｘ１５０｛Ａ，Ｒ，Ｎ，Ｄ，Ｑ，Ｅ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｋ，Ｍ，Ｆ，Ｐ，Ｓ，Ｔ，Ｗ，Ｙ，Ｖ｝，缺失，插入；　　　　Ｘ１５２｛Ａ，Ｒ，Ｎ，Ｄ，Ｑ，Ｅ，Ｈ，Ｋ，Ｆ，Ｐ，Ｗ，Ｙ，Ｖ｝；　　　　Ｘ１５３｛Ｒ，Ｎ，Ｄ，Ｑ，Ｅ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｋ，Ｍ，Ｆ，Ｔ，Ｗ，Ｙ，Ｖ｝；　　　　Ｘ１５４｛Ａ，Ｒ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｍ，Ｆ，Ｗ，Ｙ，Ｖ｝；　　　　Ｘ１６４｛Ａ，Ｒ，Ｈ，Ｔ，Ｗ｝；　　　　Ｘ１６５｛Ｒ，Ｌ，Ｆ，Ｗ，Ｙ｝；　　　　Ｘ１６６｛Ｗ，Ｙ｝，插入；　　　　Ｘ１７５｛Ｒ，Ｎ，Ｄ，Ｑ，Ｅ，Ｇ，Ｈ，Ｋ，Ｍ，Ｆ，Ｐ，Ｔ，Ｗ，Ｙ，Ｖ｝；　　　　Ｘ１７７｛Ｒ，Ｎ，Ｄ，Ｑ，Ｅ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｌ，Ｋ，Ｍ，Ｆ，Ｐ...

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：TS法诺，C冯德尔奥斯滕，MK克鲁格，M内勒高马森，
申请(专利权)人：诺和酶股份有限公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]