本发明专利技术公开了一种莲藕组织总ＲＮＡ的快速提取方法。其步骤是：首先是对实验药品的配制及实验用品的处理；其次是取材，取莲藕幼嫩的叶及与叶相连的叶柄；第三是抽提，沉淀，离心得到总ＲＮＡ；第四是总ＲＮＡ的鉴定，分别用紫外分光光度计和甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测。根据所得数据及电泳结果，表明所得莲藕组织总ＲＮＡ完整性好、纯度高并且产率高。本发明专利技术实验过程简便，操作方便、安全，结果准确、有效，重复性好，该方法也适用于富含多糖、多酚的其它物种的植物组织总ＲＮＡ的提取。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及莲藕的基因克隆、基因功能及转基因莲藕等分子生物学实验，更具体涉及一种莲藕组织总RNA的快速提取方法，适用于莲藕等富含多糖、酚类化合物植物组织总RNA的提取。
技术介绍
莲藕是一种重要的水生经济作物，不仅可以食用，而且也是重要的观赏花卉和中草药，对它的研究已经引起人们的广泛重视。就莲藕遗传学研究来看，传统的研究主要是从形态方面进行的研究，近期的研究主要是运用分子生物学的方法对其进行分子方面的研究。植物总RNA提取技术是一项植物分子生物学的基本实验技术，也是进行植物分子生物学方面研究的必要前提。只有分离得到纯度高、完整性好的高质量总RNA，才能用于Northern杂交、mRNA纯化、构建cDNA文库、通过RT-PCR分离基因以及进行蛋白质体外翻译等分子生物学实验操作。常用的植物组织总RNA提取方法有胍法、苯酚法、Tris-硼酸法、CTAB法、TRIzol试剂盒法等，这些方法已被广泛用于许多植物组织总RNA的提取，但有一些植物组织中内含物极为复杂，尤其是在富含多糖、酚类物质、脂肪及一些尚未能确定的次生代谢物质等情况下，不利于RNA的分离和纯化，因此能否有效地去除或抑制多糖、酚类等代谢物质的干扰是提取高质量植物RNA的成败的关键。一般认为在某些植物组织中，或富含多糖，或富含酚类化合物，或含有某些尚无法确定的次生代谢物质，或RNase活性较高等。在完整的细胞内这些物质在空间上与RNA是隔离的，但当组织被研磨时，细胞破碎后，这些物质就会与RNA相互作用。多糖形成难溶的胶状物，与RNA共沉淀下来；而酚类化合物极易被氧化为褐色物质，然后与RNA不可逆地结合，导致RNA活性丧失及在用氯仿抽提时RNA的丢失，或形成不溶性复合物；而分离过程中漂浮的脂肪层也不利于RNA溶液的吸取。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种莲藕组织总RNA的快速提取方法，实验过程简便，操作方便、安全，实验结果准确、有效。该方法是进行莲藕基因的克隆及功能研究、CDNA文库的构建、蛋白质体外翻译、转基因莲藕的研究等分子生物学实验的基础。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案。本专利技术提出的方法有如下步骤1.实验药品的配制与实验用品的处理实验药品的配制配制RNA提取缓冲液、10M LiCl、3M NaAc、“氯仿∶异戊醇(24∶1)”等。溶液用0.1％DEPC-H2O或RNase-free-H2O配制。实验用品的处理器皿高温(180-200℃)连续烘烤8-12小时或用0.1％DEPC-H2O浸泡过夜后120-130℃灭菌30-60分钟，电泳槽及加样梳用双氧水浸泡过夜。2.取材莲藕幼嫩的叶及与叶相连的叶柄。3.提取总RNA磨样取新鲜材料于研钵中加入缓冲液后迅速研磨。抽提用“氯仿∶异戊醇(24∶1)”抽提2-3次。沉淀加入10M LiCl，使RNA沉淀。清洗与保存清洗RNA沉淀后，于-80℃～-70℃保存。4、RNA样品得率、纯度和完整性鉴定用两种方法检测紫外吸收光谱检测、甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测。本专利技术与现有技术相比，具有以下优点和效果按常规方法，异硫氰酸胍、TRIzol试剂盒等(用异丙醇沉淀RNA)不能有效地排除多糖干扰，RNA沉淀所获得的沉淀物体积大，并且难溶于水，这说明异丙醇沉淀RNA时导致了多糖、酚类物质的共沉淀。本实验通过提高盐离子浓度，如缓冲液中加入高浓度的NaCl，抽提前又加入3M的NaAc，增加了Na+浓度，减少了多糖的干扰。还有“氯仿∶异戊醇(24∶1)”的反复抽提去除多糖。β-ME不仅能打开蛋白酶的二硫键使酶失活，从而抑制酚类氧化酶和RNase的活性，也能与酚类竞争性氧化，有抗氧化作用。适当提高β-ME在提取缓冲液的终浓度，效果更好。而PVPK30中的CO＝N有很强的结合酚类化合物的能力，与其形成稳定的复合物，使之在以后的抽提步骤中被除去，缓冲液中同时使用还原剂β-ME和螯合剂PVPK30，有效地降低了酚类物质的影响。CTAB是一种较强的去污剂，使蛋白变性的效果明显强于SDS，缓冲液中加入EDTA，能螯合Mg2+等金属离子，从而抑制各类酶的活性。Li+可将未被氧化的酚类化合物去除，也能将部分多糖留在上清液中，使RNA更易沉淀。该方法与已有的提取方法相比，操作步骤简单，提取成本低，重复性好，适用性广，能快速获得高质量、高纯度的RNA，为进一步分子生物学研究奠定了基础。同时，该方法还可用于富含多糖、酚类物质和脂肪的其它物种的植物组织总RNA的提取。附图说明图1为用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测莲藕的两种组织中总RNA，电泳后，用AlphalmagerTM2200成像系统拍照所记录的实验结果。具体实施例方式1、实验药品的配制与实验用品的处理(1)、实验药品的配制RNA提取缓冲液2％CTAB(w/v)，2-5％PVPK30(w/v)，100mMTris-Cl(PH8.0)，25mM EDTA(PH8.0)，2M NaCl，2-5％β-ME(用时加入)10M LiCl (用0.1％DEPC-H2O处理)3M NaAc(PH5.2) (用0.1％DEPC-H2O处理)96％乙醇 (用DEPC处理过的RNase-free的H2O配制)75％乙醇 (用DEPC处理过的RNase-free的H2O配制)“氯仿∶异戊醇(24∶1)”(2)、实验用品的处理 RNA提取中所有的溶液除含Tris外，均用0.1％DEPC-H2O配制，于37℃温浴12小时，并经125℃灭菌30分钟；含Tris的溶液则用DEPC处理过的RNase-free的H2O，经高压灭菌后直接配制。玻璃、陶器、金属等能经高温的器皿则于180℃连续烘烤8-12小时，塑料离心管、枪头等均用0.1％DEPC-H2O浸泡过夜后125℃灭菌30分钟，电泳槽及加样梳用双氧水浸泡过夜。2、取材取温室盆栽莲藕幼嫩的叶及与叶相连的叶柄。3、抽提，沉淀，离心得到总RNA(1)、RNA提取缓冲液于65℃水浴锅中温浴30分钟以上，然后在缓冲液中加入2-5％β-ME，立即取新鲜材料于研钵中快速研磨(一般0.1g新鲜材料/1mL缓冲液)。(2)、把研磨好的，成粘稠状的匀浆液移入离心管中，继续在65℃温浴10分钟后，加入等体积“氯仿∶异戊醇(24∶1)”，混匀，盖上盖子，上下剧烈摇动15秒，然后于4℃，12000g，离心10分钟。(3)、小心吸取上清液至一新的离心管，重复上述抽提步骤2-3次。(4)、取上清，加入1/4体积的10M LiCl溶液并混匀，4℃条件下过夜，或-20℃条件下放置6小时以上，使RNA沉淀。(4)、于4℃，12000g，离心20分钟，弃上清，获粗提的总RNA沉淀。(5)、加入DEPC处理过的RNase-free的H2O重新溶解RNA，再加入1/10体积的3M NaAc，2.5体积的96％乙醇，置于-70℃，30分钟，使RNA沉淀。(6)、于4℃，12000g，再次离心20分钟，弃上清，用70％乙醇清洗沉淀，空气中干燥后加入DEPC处理过的RNase-free的H2O溶解RNA，保存于-70℃备用(也可直接用无水乙醇保存)。4、RNA样品得率、纯度和完整性鉴定(1)、紫外吸收光谱检测用eppendorf Biophotometer紫外分光光度计测定所抽提RNA样品的A260、本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种莲藕组织总ＲＮＡ的快速提取方法，它包括下列步骤： Ａ、实验药品的配制：配制ＲＮＡ提取缓冲液、１０Ｍ ＬｉＣｌ、３Ｍ ＮａＡｃ、氯仿∶异戊醇２４∶１，溶液用０．１％ＤＥＰＣ－Ｈ↓［２］Ｏ； Ｂ、实验用品的处理：器皿用１８０－２００℃连续烘烤８－１２小时或用０．１％ＤＥＰＣ－Ｈ↓［２］Ｏ浸泡过夜后１２０－１３０℃灭菌３０－６０分钟，电泳槽及加样梳用双氧水浸泡过夜； Ｃ、取材：莲藕幼嫩的叶及与叶相连的叶柄； Ｄ、提取总ＲＮＡ：首先是磨样：取新鲜材料于研钵中加入缓冲液后研磨；其次是抽提：用氯仿∶异戊醇２４∶１抽提２－３次；第三是沉淀：加入１０Ｍ ＬｉＣｌ，使ＲＮＡ沉淀；第四是清洗与保存：清洗ＲＮＡ沉淀后，于－８０℃～－７０℃保存。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王曼玲，朱虹玲，周立，胡中立，周明全，宋运淳，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]
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