用于选择具有增强活性的酶的方法技术

在此提供的是用于增强酶活性的方法和手段。该系统利用用于将合成化合物的文库进行体外区室化的乳剂，这些合成化合物具有都直接与固相连接的基因和标记的酶底物两者。具有较大活性的表达的酶将优选从该固相中释放选择性标记，然而具有较小活性的酶将使这些标记保持完整。这些标记的化合物的去除提供了编码更具有活性的变体的富集的基因文库。还描述的是可以用于这些方法中的合成化合物和乳剂。

A method for selecting enzymes with enhanced activity

The methods and means for enhancing enzyme activity are provided here. The system utilizes the emulsions for external compartmentation of synthetic compounds library. These synthetic compounds have both direct and solid linked genes and labeled enzyme substrates. The highly active expression of the enzyme will preferably release selective markers from the solid phase, while the smaller active enzymes will keep these markers intact. The removal of these markers provides a rich gene library that encodes more active variants. It is also described that synthetic compounds and emulsions can be used in these methods.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于选择具有增强活性的酶的方法相关申请的交叉引用本申请要求2015年4月7日提交的美国临时申请号62/143,967的优先权权益，该美国临时申请的内容通过引用完全结合在此。序列表的引用本申请包括处于计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
本专利技术属于蛋白质工程设计和选择的
更具体地，本专利技术涉及借助于定向进化的酶增强。
技术介绍
使用人造区室来连接基因型和表型的体外进化是一种强大的系统，该系统允许大范围的具有不同活性的分子的进化(参见，例如，Nat.Biotechnol.[自然生物技术]，1998,16(7):652-656)。基于体外区室化(IVC)的选择最初是基于将DNA模板直接连接到目标底物(WO1999/002671A1)。在表达的活性酶的存在下将基因连接的底物转化成产物，并且对与该基因保持连接的所得产物进行阳性选择。Blazej等人披露了另一种形式的基于IVC的自体选择，在该自体选择中DNA被直接连接到能够被表达的活性酶降解的固相底物。底物降解导致活性基因被自体释放到溶液中，然后通过阴性选择从无活性的基因中分离(WO2009/124296A2)。然而，仍然需要使用类似于其天然形式的底物来针对催化活性选择基因文库的改进方法。本专利技术满足了该需求。
技术实现思路
在此描述的是用于改进酶活性的系统及其组分。因此，在一个方面中，是选择具有酶活性的多肽的方法，该方法包括：(i)将复数个合成化合物悬浮在水相中，其中这些合成化合物各自包括：(a)编码多肽的多核苷酸；(b)与所述多核苷酸连接的固相；(c)与所述固相连接的酶底物；以及(d)连接到所述底物的选择性标记；其中该水相包括用于表达该多肽的组分；(ii)与该水相形成油包水乳剂，其中这些合成化合物在该乳剂的水性液滴中被区室化；(iii)在该乳剂的水性液滴内表达这些多肽，其中在水性液滴中具有针对底物的酶活性的多肽在该液滴中释放一个或多个选择性标记；并且(iv)分离合成化合物以回收包含该选择性标记的合成化合物和/或其中选择性标记已被释放的合成化合物。在另一个方面中，是合成化合物，该合成化合物包括：(a)编码多肽的多核苷酸；(b)与所述多核苷酸连接的固相；(c)与所述固相连接的酶底物；以及(d)连接到所述底物的选择性标记；在另一个方面中，是制备该合成化合物的方法，该方法包括：(i)将该固相与编码多肽的多核苷酸连接；(ii)将该酶底物与该固相连接；(iii)将该选择性标记与该底物连接；并且(iv)回收该合成化合物。在另一个方面中，是包含复数个合成化合物的多核苷酸文库。在另一个方面中，是包含该多核苷酸文库的油包水乳剂，其中该文库的合成化合物在乳剂的水性液滴中被区室化。在另一个方面中，是制备该乳剂的方法，该方法包括：(i)将该复数个合成化合物悬浮在该水相中，并且(ii)将(i)的悬浮液与油混合。附图说明图1示出了根据本专利技术的一个方面的酶选择涉及的方法步骤的示例性图示。图2示出了如实例2所述连接到脂质酶底物的金颗粒的示例性图示。图3示出了如实例3所述的具有或不具有疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyceslanuginosus)脂肪酶(TLL)的生物素化甘油三酸酯金纳米颗粒的差别捕获。用0、5％、10％和20％的LSS1b和分散剂来制备金纳米颗粒。将纳米颗粒用TLL消化(+TLL，黑色)或不进行消化(-TLL，白色)。反应在乳剂(emul.)或游离溶液(F/S)中进行。图4示出了如实例4所述，洗涤后保留在纳米颗粒上的每个金纳米颗粒(AuNP)的寡核苷酸分子数(DNA)的数目的图。与未修饰的寡核苷酸(SR2)相比，某些偶联条件导致二硫醇修饰的寡核苷酸(SR1)的量增加，表明DNA与纳米颗粒的特异性轭合。定义氨基酸：除非另外特别指明，否则术语“氨基酸”或“氨基酸残基”包括天然存在的L-氨基酸或残基。术语“氨基酸”和“氨基酸残基”还包括D-氨基酸以及化学修饰的氨基酸(例如氨基酸类似物)、通常不被掺入蛋白质中的天然存在的氨基酸、和具有氨基酸的特有特性的化学合成的化合物(共同地，“非典型”氨基酸)。例如，允许与天然Phe或Pro相同的肽化合物构象限制的苯丙氨酸或脯氨酸的类似物或模拟物被包括在“氨基酸”的定义内。编码序列：术语“编码序列”或“编码区”意指指定一个多肽的氨基酸序列的多核苷酸序列。编码序列的边界一般由开放阅读框决定，该开放阅读框架通常以ATG起始密码子或替代性起始密码子(例如GTG和TTG)开始，并且以终止密码子(例如TAA、TAG、和TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成的多核苷酸、和/或重组多核苷酸的一个序列。控制序列：术语“控制序列”意指多肽表达所必需的核酸序列。控制序列对于编码多肽的多核苷酸可以是天然的或外源的，并且彼此可以是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于，前导子序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子序列、信号肽序列及转录终止子序列。出于引入有利于将这些控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。表达：术语“表达”包括从编码序列产生多肽的过程，并且可以包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。可以对表达进行测量—例如，来检测增加的表达—通过本领域已知的技术，例如测量mRNA和/或翻译的多肽的水平。如在此使用的表达包括体外转录/翻译。表达载体：术语“表达载体”意指线状或环状DNA分子，该DNA分子包含编码多肽的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。宿主细胞：术语“宿主细胞”意指对包括在此描述的多核苷酸(例如，编码多肽或多肽变体的多核苷酸)的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等敏感的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不一致的亲本细胞的任何后代。接头：如在此使用的术语“接头”或“连接”是指将一种参考化合物与另一种参考化合物的化学附接。突变体：术语“突变体”意指编码变体的多核苷酸。核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子包括一个或多个控制序列。该构建体可以从天然存在的基因中分离、或能以本来不存在于自然界中的方式被修饰成包含核酸的区段、或可以是合成的。可操作地连接：术语“可操作地连接”意指将控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置这样使得该控制序列指导该编码序列的表达的构型。亲本或亲本脂肪酶：术语“亲本”或“亲本多肽”意指一种多肽，对该多肽进行改变以产生酶变体。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段。多核苷酸：术语“多核苷酸”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限制，否则包括可以按类似于天然存在的核苷酸的方式发挥作用的天然核苷酸的已知类似物。术语“多核苷酸”是指任何形式的DNA或RNA，包括例如基因组DNA；互补DNA(cDNA)，其是信使RNA(mRNA)的DNA表示，通常通过mRNA的反转录或扩增获得；合成地或通过扩增产生的DNA分子；以及mRNA。术语“多核苷酸”涵盖双链核酸分子以及单链分子。在双链多核苷酸中，多核苷酸链无需是共延伸的(即，双链多核苷酸无需沿着两条链的整个长度是双链的)。如果多核苷酸在结构(例如核苷酸序列)上不同，就说它们是“不本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种选择具有酶活性的多肽的方法，该方法包括：(i)将复数个合成化合物悬浮在水相中，其中这些合成化合物各自包括：(a)编码多肽的多核苷酸；(b)与所述多核苷酸连接的固相；(c)与所述固相连接的酶底物；以及(d)连接到所述底物的选择性标记；其中该水相包括用于表达该多肽的组分；(ii)与该水相形成油包水乳剂，其中这些合成化合物在该乳剂的水性液滴中被区室化；(iii)在该乳剂的水性液滴内表达这些多肽，其中在水性液滴中具有针对该底物的酶活性的多肽在该液滴中释放一个或多个选择性标记；并且(iv)分离这些合成化合物以回收包含该选择性标记的合成化合物和/或其中该选择性标记已经被释放的合成化合物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.04.07 US 62/143,9671.一种选择具有酶活性的多肽的方法，该方法包括：(i)将复数个合成化合物悬浮在水相中，其中这些合成化合物各自包括：(a)编码多肽的多核苷酸；(b)与所述多核苷酸连接的固相；(c)与所述固相连接的酶底物；以及(d)连接到所述底物的选择性标记；其中该水相包括用于表达该多肽的组分；(ii)与该水相形成油包水乳剂，其中这些合成化合物在该乳剂的水性液滴中被区室化；(iii)在该乳剂的水性液滴内表达这些多肽，其中在水性液滴中具有针对该底物的酶活性的多肽在该液滴中释放一个或多个选择性标记；并且(iv)分离这些合成化合物以回收包含该选择性标记的合成化合物和/或其中该选择性标记已经被释放的合成化合物。2.如权利要求1所述的方法，其中该油包水乳剂中不超过20％的水性液滴包括多于一个合成化合物。3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该乳剂包括至少约106个水性液滴/mL乳剂(例如，至少约109、1012或1015个水性液滴/mL乳剂)。4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该选择性标记是亲和标签(例如，生物素)。5.如权利要求11所述的方法，其中步骤(iv)的包含该选择性标记的合成化合物用链霉亲和素(例如链霉亲和素涂覆的微球)分离。6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该固相是微珠或颗粒。7.如权利要求6所述的方法，其中该固相是疏水性微珠。8.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中该固相是金纳米颗粒。9.如前述权利要求中任一项...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·布拉扎伊，N·托列洛，C·埃姆里克，A·斯文森，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：丹麦,DK