微生物表达的用于动物饲料的耐热植酸酶制造技术

本发明专利技术提供了制造和使用耐热植酸酶的方法，如在饲料和食品加工过程中利用耐热植酸酶的方法，还提供了含有耐热植酸酶的饲料和食品。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
总体上说，本专利技术涉及的是分子生物学领域，更具体地说，是涉及耐热植酸酶的使用。
技术介绍
植酸酶(肌醇六磷酸酶(myo-inositol hexakisphosphatephosphohydrolase)，EC3.1.3.8)是一类能将植酸盐(肌醇六磷酸盐)水解成肌醇和无机磷酸盐的酶。已知这种酶是有价值的饲料添加剂。在二十世纪末，植酸酶作为动物饲料添加剂每年的销售额估计超过1亿美元，而且还在增长。家禽和猪的食物现在主要是谷类食品，豆类食品和含油种子。这些饲料中大约2/3的磷是以植酸盐形式存在的，而植酸盐是植酸的盐类物质(肌醇六磷酸盐，InsP6)(Jongbloed等人，1993)。植物中的植酸磷是植酸的钙-镁-钾盐混合物，在植物中以螯合物的形式存在，溶解度很低(Pallauf和Rimbach，1997)。这种形式的磷很难被单胃动物如人、猪和家禽消化/利用。为了利用植酸盐中的磷、矿物质和结合在植酸复合物上的微量元素，用植酸酶将植酸上的酯类结合磷酸基团进行水解是有必要的(Rimbach等人，1994)。植酸酶是一类特殊的磷酸酶，它能将植酸盐水解成一系列的低级的肌醇磷酸酯和磷酸盐。已知了两类植酸酶3-植酸酶和6-植酸酶，从而表明了最初最容易受到攻击的磷酸酯键。尽管单胃动物缺乏足够的植酸酶来利用植酸盐中的磷，但可以将许多能产生植酸酶的真菌、细菌和酵母补充到动物的口粮中。添加植酸酶对磷消化率和动物的生长性能产生有利的影响，这在许多文献中已经被很好地证明了(Mroz等人，1994；Kornegay等人，1996；Rao等人，1999；Ravindran等人，1999)。然而，绝大部分制造商做的研究都是出于一个特别的目的，它们只是肤浅地把提供这种酶作为一种市场战略。任何酶制剂的效力不仅取决于酶的类型，内含物等级(inclusion rate)，和出现的活性水平，也取决于酶在不同条件下保持其活性的能力，这些不同条件包括在整个胃肠道中遇到的不同条件和在食品和饲料制剂前处理中采用的不同条件。尽管许多植酸酶都可以用作补充物，但这类酶中的许多都有某些缺陷。例如，许多现在使用的植酸酶在饲料粒化过程中由于热处理而失去活性。此外，许多现在使用的酶在磷酸钙补充水平低的食物中的量不足。因此，我们需要的是在动物饲料和食品加工过程性质改进的植酸酶。专利技术概述因此，本专利技术提供了制备和使用核酸分子(多聚核苷酸)的方法，这些核酸分子编码耐热植酸酶，即在大约60℃，30分钟后还能保持至少40％活力的植酸酶，而且这种植酸酶有高的比活性，即在37℃和酸性pH，如pH4.5时，其比活性至少是200U/mg。在一个实施方案中，本专利技术提供了制备耐热植酸酶的方法。方法包括在微生物宿主细胞中表达表达盒，该表达盒含有启动子，它可操作地连接在核酸分子上，该核酸分子编码耐热植酸酶，耐热植酸酶在大约60℃，30分钟后还能保持至少40％的活力，而且这种植酸酶在pH4.5和37℃时，比活性大于200U/mg。微生物宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞(如埃希氏菌属，假单胞菌，乳酸菌和杆状菌)，酵母(如酵母菌属，裂殖酵母属，毕赤酵母属或hansuela)或真菌(如曲霉菌或木霉菌)细胞。在一个优选的实施方案中，用来制备重组耐热植酸酶的微生物细胞产生的是重组耐热植酸酶的糖基化形式。优选的是将编码耐热植酸酶的多聚核苷酸(第一多聚核苷酸)可操作地连接到至少一个调控元件如启动子，增强子，内含子，终止序列，或它们的组合序列上，或者，也可任选地将第一多聚核苷酸连接到第二多聚核苷酸上，第二多聚核苷酸编码信号肽，它能指导第一多聚核苷酸编码的酶到特定的细胞位置上，如胞外。启动子可以是组成型的，也可以是诱导型(有条件的)的启动子。如本专利技术介绍的那样，对编码植酸酶的亲本(细菌的)多聚核苷酸进行突变，能产生变异(合成的)的DNAs，它编码的植酸酶相对亲本多聚核苷酸编码的植酸酶而言，性质有了改进。在一个实施方案中，将许多变异DNAs上的突变结合制备一个合成的多聚核苷酸，相对亲本多聚核苷酸来说，它编码的植酸酶耐热性和胃稳定性增强，具有相似或更高的比活性。获得亲本多聚核苷酸的来源包括植物，细菌或真菌核酸，可以采用任何方法从选择的亲本多聚核苷酸中制备本专利技术的合成多聚核苷酸，这些方法如组合诱变，回归诱变和/或DNA重排。因此，在本专利技术的一个实施方案中，和对应(用作参考的)的耐热植酸酶相比，这种耐热植酸酶有一或多个氨基酸取代，这种取代和植酸酶在60℃或高于60℃时活力的保持相关。优选的是，这种耐热植酸酶在大约60℃，30分钟后还能保持至少40％的活力，更优选的是，在大约65℃，30分钟后还能保持至少40％的活力，更进一步优选的是，在大约70℃，30分钟后还能保持至少35％的活力，而且，这种植酸酶在37℃和酸性pH，如pH5.0，更优选的是少于4.0和大于1.5的情况下，至少有400U/mg的比活力，更优选的是至少有600U/mg的比活力，更进一步优选的是至少有800U/mg的比活力。SEQID NO1中提供的是本专利技术典型的耐热植酸酶的例子。本专利技术也提供了载体和转化的微生物细胞，载体含有本专利技术表达盒或多聚核苷酸，而微生物细胞含有本专利技术多聚核苷酸、表达盒或载体。本专利技术载体编码多个多肽，或编码融合多肽，其中多肽包括多个植酸酶，而融合多肽含有本专利技术的耐热植酸酶，转化的微生物细胞可能包括一或多个本专利技术的载体。本专利技术的转化细胞用来制备本专利技术的重组耐热植酸酶。因此，本专利技术提供从本专利技术转化的微生物细胞中分离出来的耐热植酸酶，以及合成的植酸酶。本专利技术进一步提供的是配制耐热植酸酶、植酸酶制剂或酶混合物的方法。重组的耐热植酸酶或其制剂可以在食品或饲料加工之前、加工过程中、或之后加入，作为食品或饲料的一种添加剂或成分。优选的是，本专利技术的重组制酸酶可以在加热(如蒸汽)之前或加热过程中加入制片机(pellet mill)中的饲料成分的混合物中。因此，本专利技术包括制造和使用耐热植酸酶的方法。在饲料配制过程中，因为本专利技术的植酸酶能够耐受商用制片机的加热，所以本专利技术进一步提供的是一种制造动物饲料，如含有耐热植酸酶的饲料硬颗粒的方法。饲料制造方法包括混合配制的植酸酶和动物饲料成分；设定制片机中混合物蒸汽应达到的条件经过预热处理，至少保持50％的酶活力；并且通过pellet dye将饲料挤压出来。因此，除了可以和维生素，矿物质，别的饲料酶，农业上的副产品(如粗小麦粉或玉米蛋白粉)，或它们的组合物一块添加到动物饲料中外，植酸酶也可单独用作动物饲料的补充料。粉状食物，即没通过制粒机的食物中也可添加这种酶。现在通过商业途径获得的植酸酶不耐热，因此一般都是在粒化后添加，一般都是将这种酶溶液喷洒到粒化的饲料上。伴随喷洒方法出现的问题是只有百分比很小的颗粒能和酶联系，而这酶只是存在于有涂层的颗粒表面，此外饲料厂还必须购买和操作复杂的喷洒机器。相反，本专利技术的耐热植酸酶，它的比活力比别的在商业上获得的植酸酶要高8倍，可以在粒化之前加入，从而使饲料产品中这种酶的分布状况得到改善。此外，因为喷洒过程中要带入一些湿气，而贮存期间这种湿气会支持真菌和细菌的生长，因此，和用喷洒植酸酶方法获得的饲料相比，含有本专利技术植酸酶的的饲料具有更长的保存限期。进一步说，由于本文档来自技高网...

【技术保护点】
制备耐热植酸酶的方法，包括：在微生物宿主细胞中表达一种表达盒，该表达盒包括启动子，所述启动子可操作地连接在编码耐热植酸酶的核酸分子上，所述耐热植酸酶在６０℃培养３０分钟后能保留至少４０％的活性，并且在ｐＨ４．５和３７℃时，具有大于２００Ｕ／ｍｇ的比活性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：MB拉纳汉，E克普夫，K克雷茨，
申请(专利权)人：先正达公司，戴弗萨公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]