本发明专利技术公开了一种亲本α－淀粉酶的变体，该亲本α－淀粉酶：（ｉ）具有选自分别在ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３和ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７中所示的氨基酸序列的氨基酸序列；或（ｉｉ）和这些氨基酸序列中的一种或多种显示出至少８０％的同源性；和／或显示出与由抗具有这些氨基酸序列之一的α－淀粉酶产生的抗体的免疫交叉反应性；和／或由与编码具有这些氨基酸序列之一的α－淀粉酶之ＤＮＡ序列相同的探针杂交的ＤＮＡ序列编码；在这种变体中：（ａ）至少一种所说的亲本α－淀粉酶的氨基酸残基已被缺失；和／或（ｂ）至少一种所说的亲本α－淀粉酶的氨基酸残基已被一种不同的氨基酸残基取代；和／或（ｃ）相对亲本α－淀粉酶而言至少有一种氨基酸残基已被插入；所说的变体具有α－淀粉酶活性并且相对于亲本α－淀粉酶表现出至少一种下列性质：增加的热稳定性；增加的氧化稳定性；降低的Ｃａ↑［２＋］依赖性；其条件是所说的变体的氨基酸序列不与分别在ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３和ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７中所示的氨基酸序列之任一相同。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及相对于亲本酶而言具有改良的性质(如，改良的热和/或氧化稳定性和/或降低的钙离子依赖性)并由此改良了洗涤和/或餐具洗涤(和/或纺织品去浆)性能的α-淀粉酶变体。本专利技术也涉及编码所说的变体的DNA构建体以及携带DNA构建体的载体和细胞。本专利技术还涉及产生淀粉酶变体的方法以及包含淀粉酶变体的去垢剂添加剂和去垢组合物。本专利技术还涉及淀粉酶变体在纺织品去浆上的用途。
技术介绍
α-淀粉酶在工业上使用了很多年，用途很广，其中最重要的是淀粉液化、纺织品去浆、在造纸和纸浆工业方面淀粉改性以及用于酿酒和烘烤。另一个日益重要的α-淀粉酶的用途是在洗涤或餐具洗涤期间除去含淀粉的污垢。 近年来试图构建具有对特异性用途(如淀粉液化和纺织品去浆)的改良的性质的α-淀粉酶变体。 例如，美国5,093,257公开了包含嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶N-末端一部分和地衣芽孢杆菌α-淀粉酶C-末端一部分的嵌合α-淀粉酶。据记载，嵌合α-淀粉酶具有独特的性质，如与其亲本α-淀粉酶相比不同的热稳定性。然而，所有具体描述的嵌合α-淀粉酶与其亲本α-淀粉酶相比表现出降低的酶促活性。 EP252 666描述了通式为Q-R-L的杂种淀粉酶，其中Q是从55至60的氨基酸残基的N-末端多肽残基，它与已说明的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的57N-末端氨基酸残基至少75％是同源的，R是已说明的多肽，L是包含390至400氨基酸残基的C-末端多肽，它与已说明的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的395C-末端氨基酸残基至少75％是同源的。 Suzuki等(1989)公开了嵌合α-淀粉酶，其中液解化淀粉杆菌α-淀粉酶的指定区域已被地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的相应区域替代。为了鉴别对热稳定性起作用的区域，构建了嵌合α-淀粉酶。发现这样的区域包括液解化淀粉杆菌α-淀粉酶的氨基酸残基第177-186和氨基酸残基255-270。在嵌合α-淀粉酶中氨基酸残基的改变似乎不影响酶的性质，而非其热稳定性。 WO 91/00353公开了至少一种氨基酸残基与其亲本α-淀粉酶不同的α-淀粉酶突变体。在所说的专利申请中公开的α-淀粉酶突变体由于其氨基酸取代应用于淀粉降解和/或纺织品去浆表现出改良的性质。一些突变体表现出稳定性提高，但是没有报道或指出酶促活性的改进。仅作为例子说明的突变体从亲本地衣芽孢杆菌α-淀粉酶制备，它携带下列突变之一H133Y或H133Y+T1491。已证明的另一个突变是A111T。 FR 2,676,456公开了地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的突变体，其中在组氨酸133附近的一种氨基酸残基和/或丙氨酸209附近的一种氨基酸残基已被一种更疏水的氨基酸残基取代。据记载，产生的α-淀粉酶突变体具有改良的热稳定性，在纺织品、造纸、酿酒和淀粉液化工业中是有用的。 EP 285 123公开了进行核苷酸序列随机诱变的方法。作为这样的序列的一个例子提到了编码嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的核苷酸序列。当突变时，获得了在低pH值下具有改良的活性的α-淀粉酶变体。 在上述参考中没有一个提到甚至暗示可以构建对去垢剂工业来说有改良的性质的α-淀粉酶突变体。 EP 525 610涉及具有对表面活化剂改良的稳定性的突变体酶。突变体酶通过亲本酶的表面部分的一种氨基酸残基已被另一种氨基酸残基取代产生。在EP 525 610中具体描述的唯一突变体酶是蛋白酶。淀粉酶作为可获得对表面活化剂改良的稳定性的酶的例子被提到，但是淀粉酶的类型、起源或特异性的突变都没指明。 WO 94/02597公开了在氧化剂存在下表现出改良的稳定性和活性的α-淀粉酶突变体。在突变体α-淀粉酶中，一个或多个甲硫氨酸残基已被不同于半胱氨酸和甲硫氨酸的氨基酸残基取代。据记载，α-淀粉酶突变体可用于去垢剂和/或餐具洗涤添加剂以及纺织品去浆。 WO 94 18314公开了对氧化稳定的α-淀粉酶突变体，包括在地衣芽孢杆菌α-淀粉酶M197位置的突变。 EP 368 341描述了与/不与用于洗涤和餐具洗涤的α-淀粉酶组合的支链淀粉酶和其它淀粉分解酶。 本专利技术的一个目的是提供α-淀粉酶变体，该变体相对于其亲本α-淀粉酶具有重要的改良性质，特别是有关所说的变体的洗涤和/或餐具洗涤性能，例如，增加的热稳定性、增加的氧化稳定性、降低的对Ca2+离子的依赖性和/或在适当的pH值区域中(例如，洗衣或餐具洗涤)改良的稳定性或活性。这样的变体α-淀粉酶有优势，其中，它们可以在比其亲本α-淀粉酶更低的剂量下使用。而且，α-淀粉酶变体可以除去含淀粉的污垢，而此污垢不能(或有困难)用目前已知的α-淀粉酶去垢剂酶除去。 专利技术的简要说明 作为本专利技术基础的工作的目的在于改良(如果可能的话)α-淀粉酶(特别是，具体来说从芽孢杆菌菌株获得的α-淀粉酶)的稳定性，这些α-淀粉酶以其在碱性介质(如在洗衣或餐具洗涤中典型使用的去垢剂溶液)中除去淀粉的性能为基础相对于目前市售的α-淀粉酶选择。在这方面，本专利技术的专利技术人令人惊奇地发现事实上可以通过亲本α-淀粉酶的氨基酸序列的不同区域的一种或多种氨基酸残基的合理修饰来改良这样的亲本α-淀粉酶的上述类型(见上)的性质。本专利技术以此发现为基础。 因此，本专利技术的第一个方面涉及亲本α-淀粉酶的变体，所说的亲本α-淀粉酶是一种 i)具有分别在本文的SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列之一；或 ii)与在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.7中所示的一种或多种氨基酸序列表现出至少80％的同源性；和/或显示出与由抗具有分别在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列之一的α-淀粉酶产生的抗体的免疫交叉反应性；和/或由与编码具有分别在SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQID No.7中所示的氨基酸序列之一的α-淀粉酶之DNA序列相同的探针杂交的DNA序列编码。 本专利技术的α-淀粉酶变体所符合的条件为该变体是不与在SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3或SEQ ID No.7中所示的氨基酸序列有相同的氨基酸序列的变体。 编码所述的前三个α-淀粉酶氨基酸序列的DNA序列在SEQ ID No.4(编码在SEQ ID No.1中所示的氨基酸序列)、SEQ ID No.5(编码在SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列)和SEQ ID No.6(编码在SEQ ID No.3中所示的氨基酸序列)中显示。 在WO 95/26397中也公开了SEQ ID No.1和SEQ ID No.2亲本α-淀粉酶的氨基酸序列和相应的DNA序列(分别为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5)(和本专利申请的SEQ ID NOs.相同)。 本专利技术的变体是这样的变体，其中(a)至少一种所说的亲本α-淀粉酶的氨基酸残基已被缺失；和/或(b)至少一种所说的亲本α-淀粉酶的氨基酸残基已被一种不同的氨基酸残基取代；和/或(c)相对亲本α-淀粉酶而言至少有一种氨基酸残基已被插入；所说的变体具有α-淀粉酶本文档来自技高网...
【技术保护点】
α－淀粉酶变体，其中所述的变体具有α－淀粉酶活性，并按ＳＥＱＩＤＮＯ：３的编号方式包含１７９位和１８０位氨基酸的缺失，并且其中所述的变体与ＳＥＱＩＤＮＯ：３或嗜热脂肪芽孢杆菌α－淀粉酶具有至少９５％的同源性。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：H比斯加德佛兰茨，A斯文森，TV伯切尔特，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]
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