分析细胞增殖性病症的方法和核酸技术

本发明专利技术涉及分析细胞增殖性病症的方法和核酸。本发明专利技术提供用于检测，或用于检测和区分肝细胞增殖性病症或用于检测和区分结肠直肠细胞增殖性疾病的方法、核酸和试剂盒。具体方面公开和提供基因组序列，其甲基化模式对于所述病症种类的改进的检测和区分有重要的用途，由此使得对患者的改进的诊断和治疗成为可能。

Methods and nucleic acids for analysis of cell proliferation diseases

The present invention relates to a method of analysis of a cell proliferation disease and a nucleic acid. The invention provides methods, nucleic acids and kits for detecting or identifying hepatocyte proliferative disorders or for detecting and distinguishing colorectal proliferative diseases. In specific aspects, the genome sequence is disclosed and provided. Its methylation mode has important applications for the improved detection and differentiation of the disease categories, thus making it possible to improve the diagnosis and treatment of patients.

【技术实现步骤摘要】
分析细胞增殖性病症的方法和核酸本申请是针对申请号为201410147754.X、专利技术名称为“分析细胞增殖性病症的方法和核酸”的中国专利申请的分案申请，该申请是2014年4月10日提交的分案申请。本申请所针对的申请是申请号为200680012490.0、专利技术名称为“分析细胞增殖性病症的方法和核酸”的中国专利申请的分案申请，该母案申请是2006年4月17日提交的PCT国际专利申请PCT/US2006/014131进入中国国家阶段的申请。
本专利技术涉及在相对于正常状态的疾病状态中表现出改变的表达模式的基因组序列。具体的实施方案提供了检测或者检测和区别细胞增殖性病症的方法、核酸、核酸阵列和试剂盒等。优选地，用于检测和诊断细胞增殖性病症的方法、核酸、核酸阵列和试剂盒可用于诊断癌症，尤其是结肠直肠和/或肝癌。相关申请的参考本申请要求2005年4月15日递交的美国临时专利申请60/672,242；2005年5月2日递交的60/676,997；2005年7月8日递交的60/697,521；2005年8月1日递交的60/704,860；2005年8月17日递交的60/709,318；2005年10月4日递交的60/723,602；以及2006年3月30日递交的60/787,402的优先权，将它们的整体都以参考方式并入本文。序列表按照37C.F.R.§1.52(e)(5)要求的序列表已作为1.82MB文本文件在以光盘(一张)提供，标题为“47675-187SequenceListing.txt”，将其整体通过参考方式并入本文。
技术介绍
癌症的发病率和诊断。癌症在美国是第二位的主要死因。如果当前的筛选方法在患者顺应性、敏感性和易于筛选方面有所改进，则死亡率会有明显改善。现有的建议用来诊断癌症的方法一般是昂贵的，并且不适于用作人群广泛筛选测试。肝细胞癌(HCC)是世界上第四常见的癌症，其发生率从北美的每100,000人中2.1个至中国每100,000人中80个。在美国，据估计在2005年会有17,550新诊断病例并且15,420人因此死亡。肝脏超声、α甲胎蛋白水平和常规CT扫描通常用于HCC(肝细胞或原发肝癌)的诊断评估，但是它们通常太不灵敏而不能用来检测多病灶的小损伤和用于作出治疗计划。在美国，结肠直肠癌的年发病率大约为150,000，每年有56,600个体死于结肠直肠癌。在普通群体中结肠直肠癌的终生风险(lifetimerisk)是约5至6％。尽管最近几年在筛选和早期检测结肠癌方面有不少努力，但至今很多病例仍是在具有局部或远处转移的晚期被诊断出来。尽管治疗选择包括手术和辅助或姑息性化学治疗，但很多患者还是在几个月内死于它们癌症的进展。鉴定结肠癌发展中的分子变化可以帮助开发新的监测、筛选、诊断和治疗手段，它们会改善这些患者总的不良预后。依照美国癌症协会，用于结肠直肠筛选的现有指导是使用五种不同手段之一在50岁或更大年龄平均风险个体中筛选。这些手段包括1)每年大便潜血测试(FOBT)，2)每五年进行可曲性乙状结肠镜检查，3)每年的FPBT加上每五年的可曲性乙状结肠镜检查，4)每五年的双重对比钡剂灌肠法或5)每10年的结肠镜检查。尽管这些测试程序被医学界广泛接受，实施对结肠直肠癌的广泛筛选还没有实现。由于与这些操作相关的不适或不便，患者依从性是限制使用的主要因素。尽管FOBT测试是非侵入性操作，但是需要测试前3-5天的饮食和其它限制。这些测试的敏感性水平对于结肠直肠腺癌来说也非常低，依赖于试验而有较大波动。由于大多数腺瘤并不出血，对于检测腺瘤的敏感性测量来说则更差。相反，因为直接观察到结肠的内腔，更侵入性的操作如乙状结肠镜检查和结肠镜检查的敏感性则相当高。非随机的试验已评估了这些技术的有效性，但是使用病例对照研究的数据和来自国家息肉研究(NationalPolypStudy)(美国)的数据已显示除去腺瘤性息肉将导致CRC发病率76-90％的降低。乙状结肠镜检查的局限性在于仅观察结肠的左侧，右侧结肠的损伤不被检测到。两种镜检操作都是昂贵的，要求使用泻药制剂，并具有增加的发病率和死亡率风险。显然，在结肠直肠癌的通用广泛筛选变得普通之前，需要具有增加的敏感性、特异性、易于使用和降低的费用的改进测试。早期结肠直肠检测通常是基于在无症状个体上每年进行的大便潜血测试(FOBT)。由包括美国癌症协会在内的几个医疗组织改编的当前建议要求大便潜血测试在年龄50开始，每年重复，直至患者不再能从筛查受益。阳性FOBT导致对肠的结肠镜检查；这是昂贵和侵入性的操作，具有每5,000检查中1个的严重并发症发病率。只有12％的具有血红素阳性大便的患者在结肠镜检时被诊断为癌症或大息肉。许多研究显示FOBT筛查不改善癌症相关的死亡率或整体存活率。对大便潜血测试的依从性很差，少于20％的群体按建议提供或完成FOBT。如果FOBT恰当地完成，则患者从三个顺序的肠运动收集粪样品。在患者遵从饮食指导并避免已知引起隐蔽胃肠道出血的药物时获得样品。实际上，医师常常没有恰当地指导患者，患者常常不按试验计划进行，并且一些患者发现收集大便样品的任务很困难或令人不快，从而与大便潜血测试有关的依从性很差。如果能相对于当前方法改进测试敏感性和特异性，则可降低测试的频率，消除连续收集样品、消除饮食和药物计划变动并改善患者依从性。伴随依从性问题的还有，FOBT检测结肠癌的敏感性和特异性很差。差的特异性导致不必要的结肠镜检，使结肠癌筛查增加了相当的费用。FOBT的特异性已被计算为至多96％，而敏感性为43％(腺瘤)和50％(结肠直肠癌)。采用免疫测定FOBT可改进敏感性，如商标为“InSureTM”的产品，具有改进的敏感性77％(腺瘤)和88.9％(结肠直肠癌)。分子疾病标志物。分子疾病标志物比其它类型的标志物具有几个优势，一个优势是即使样品量很小的样品和/或组织结构没有被维持的样品也能够相当有效地分析。在最近10年中，很多基因已显示在正常和结肠癌之间差异表达。但是，没有单一标志物或标志物组合被证实足以诊断结肠癌。基于大尺寸mRNA(High-dimensionalmRNA)的方法最近被证实能够提供更好的手段来区分不同的肿瘤类型以及良性和恶性病变。但是，其作为常规诊断工具在临床环境中的应用被以下原因所阻碍：mRNA的极度不稳定、在某些触发物作用下快速出现的表达变化(例如样品收集)以及，更重要地，分析需要大量的mRNA(Lipshutz，R.J.等人，NatureGenetics21：20-24，1999；Bowtell，D.D.LNaturegeneticssuppl.21：25-32，1999)，其通常不能从常规活检获得。已建议使用生物标志物来进一步改善FOBT的敏感性和特异性，这类测试的实例包括可从EXACTSciences获得的PreGen-PlusTM大便分析测试，其具有20％(腺癌)和52％(结肠直肠癌)的敏感性，两种情况下特异性均为95％。这种测试测定与结肠瘤的发生有关的23种DNA突变的存在。将DNA甲基化用作结肠癌标志物是已知的。例如，Sabbioni等人(MolecularDiagnosis7：201-207，2003)在98％结肠癌患者外周血中检测由T本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测和/或分类个体中细胞增殖性病症的方法，包括确定分离自所述个体的生物样品中至少一种选自Septin 9(包括其所有的转录本变体)、FOXL2、SARM1、VTN、PRDM6、NR2E1、FAT以及SEQ ID NO：160至SEQ ID NO：165的基因或基因组序列的表达水平，其中欠表达和/或CpG甲基化表明所述病症存在或其种类。

【技术特征摘要】
2005.04.15 US 60/672,242;2005.05.02 US 60/676,997;1.检测和/或分类个体中细胞增殖性病症的方法，包括确定分离自所述个体的生物样品中至少一种选自Septin9(包括其所有的转录本变体)、FOXL2、SARM1、VTN、PRDM6、NR2E1、FAT以及SEQIDNO：160至SEQIDNO：165的基因或基因组序列的表达水平，其中欠表达和/或CpG甲基化表明所述病症存在或其种类。2.如权利要求1所述的方法，其中癌性细胞增殖性病症区别于良性细胞增殖性病症，所述方法特征在于欠表达和/或CpG甲基化的存在表明癌性细胞增殖性病症的存在，而其不存在表明良性细胞增殖性病症的存在。3.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞增殖性病症为癌症。4.如权利要求3所述的方法，其中所述细胞增殖性病症为肝细胞或结肠直肠癌。5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述表达水平通过检测从所述基因转录的mRNA的存在与否或水平来确定。6.如权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述表达水平通过检测由所述基因或其序列编码的多肽的存在与否或水平来确定。7.如权利要求6所述的方法，其中所述多肽通过一种或多种选自western印迹分析、色谱法、免疫分析、ELISA免疫分析、放射免疫分析、抗体法及其组合来检测。8.如权利要求1-4任一项所述的方法，其中所述表达通过检测所述基因内CpG甲基化的存在与否来确定，其中甲基化的存在表明细胞增殖性病症的存在。9.检测和/或分类个体中细胞增殖性病症的方法，包括使从所述个体生物样品中分离的基因组DNA与至少一种试剂或成组试剂接触，所述至少一种试剂或成组试剂区分所述基因组DNA至少一个靶区域内甲基化和未甲基化CpG二核苷酸，其中所述靶区域包含或在严紧条件下杂交于至少一种分别选自SEQIDNO：1至SEQIDNO：3、SEQIDNO：24、SEQIDNO：28、SEQIDNO：159至SEQIDNO：167的序列的至少16连续核苷酸的序列，其中所述连续核苷酸包含至少一个CpG二核苷酸序列，由此至少部分地提供对细胞增殖性病症的检测和/或分类。10.检测和/或分类个体中细胞增殖性病症的方法，包括：a.提取或以其它方式从所述个体生物样品分离基因组DNA；b.用一种或多种试剂处理a)的所述基因组DNA或其片段，以便将其5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或在杂交性能方面可检测地不同于胞嘧啶的其它碱基；c.使所述经处理的基因组DNA或其经处理的片段与扩增酶和至少一种引物接触，所述引物包括至少9核苷酸的连续序列，其互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于选自SEQIDNO：10至SEQIDNO：15、SEQIDNO：28至SEQIDNO：33、SEQIDNO：30至SEQIDNO：31、SEQIDNO.42至SEQIDNO：43、SEQIDNO：38至SEQIDNO：39、SEQIDNO：50至SEQIDNO：51、SEQIDNO：168至SEQIDNO：203及其互补序列的序列，其中所述经处理的基因组DNA或其片段被扩增以产生至少一种扩增产物或不被扩增；以及d.基于所述扩增物是否存在或其性质，确定选自SEQIDNO：1至SEQIDNO：3、SEQIDNO：24、SEQIDNO：28、SEQIDNO：159至SEQIDNO：167的序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态或水平，或者反映选自SEQIDNO：1至SEQIDNO：3、SEQIDNO：24、SEQIDNO：28、SEQIDNO：159至SEQIDNO：167的序列的多个CpG二核苷酸平均甲基化状态或水平的均值或值，由此至少部分地提供至少检测和分类细胞增殖性病症之一。11.如权利要求9所述的方法，其中b)中处理所述基因组DNA或其片段包括使用选自亚硫酸氢盐、酸式亚硫酸盐、disulfite及其组合的试剂。12.如权利要求9所述的方法，其中c)中的接触或扩增包括使用至少一种选自如下的方法：使用耐热DNA聚合酶作为所述扩增酶；使用缺乏5’-3’外切酶活性的聚合酶；使用聚合酶链式反应(PCR)；产生带有可检测标记的扩增产物核酸分子。13.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中从所述个体获得的所述生物样品选自细胞系、组织学切片、组织活检、石蜡包埋的组织、体液、粪便、结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、从血液中分离的细胞，或其组合。14.如权利要求10所述的方法，还在步骤d)中包括使用至少一种核酸分子或肽核酸分子，其在各种情况下都包含互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于选自SEQIDNO：10至SEQIDNO：15、SEQIDNO：28至SEQIDNO：33、SEQIDNO：30至SEQIDNO：31、SEQIDNO：42至SEQIDNO：43、SEQIDNO：38至SEQIDNO：39、SEQIDNO：50至SEQIDNO：51、SEQIDNO：168至SEQIDNO：203序列及其互补序列的至少9核苷酸长度的连续序列，其中所述核酸分子或肽核酸分子抑制其所杂交的所述核酸的扩增。15.如权利要求10所述的方法，其中d)中的确定包括至少一种核酸分子或肽核酸分子的杂交，所述至少一种核酸分子或肽核酸分子在各种情况下包含互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于选自SEQIDNO：10至SEQIDNO：15、SEQIDNO：28至SEQIDNO：33、SEQIDNO：30至SEQIDNO：31、SEQIDNO：42至SEQIDNO：43、SEQIDNO：38至SEQIDNO：39、SEQIDNO：50至SEQIDNO：51、SEQIDNO：168至SEQIDNO：203序列及其互补序列的至少9核苷酸长度的连续序列。16.如权利要求15所述的方法，其中至少一种这种杂交核酸分子或肽核酸分子被连接到固相。17.如权利要求15所述的方法，还使至少一种这种杂交的核酸分子延伸至...

【专利技术属性】
技术研发人员：尤金·迪斯特勒，托马斯·希尔德曼，拉尔夫·莱舍，卡西·洛夫顿戴，法比安·莫德尔，马蒂亚斯·许特尔，安德鲁·希莱杰夫斯基，宋晓龄，雷莫·特茨纳，
申请(专利权)人：EPI基因组股份公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE