中国青岛文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶基因及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种中国青岛文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶基因及其编码的蛋白，以及该蛋白在制备抗肿瘤和抗衰老的药物中的作用。本发明专利技术用ＲＴ－ＰＣＲ的方法，从中国青岛文昌鱼卵巢总ＲＮＡ中分离得到的硫氧还蛋白过氧化物酶基因ＴＰｘ，其ＤＮＡ序列如序列表中〈４００〉１序列所示。该基因编码的蛋白（重组硫氧还蛋白过氧化物酶Ｂｂｔ－ＴＰｘ），其氨基酸序列如序列表中〈４００〉２序列所示。本发明专利技术的重组硫氧还蛋白过氧化物酶具有抗氧化作用，可用于制备抗肿瘤和抗衰老的药物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种中国青岛文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶基因及其编码的蛋白，以及该蛋白在制备抗肿瘤和抗衰老的药物中的应用。
技术介绍
文昌鱼，鱼肉红色，晶莹、半透明状。身体细长象一把外科手术刀，所以西欧人叫它两尖鱼或海茅。文昌鱼共有29个种。分布在热带、亚热带的8～16米的浅水海域中，特别在北纬48°至南纬40°之间的环形地区。虽然文昌鱼不属于脊椎动物，但它胚胎发生出现的脊索、神经管及咽鳃裂表现了脊椎动物胚胎发生的共性，因而在动物进化树上占据着及其重要的地位。因此，时至今日，当代胚胎学仍把文昌鱼的胚胎发生作为脊椎动物胚胎发生的基本模式。过氧化物还原酶(Peroxiredoxins Prx)是生物体内一类抗氧化蛋白酶。自从1988年K·Kim在酿酒酵母里发现过氧化物还原酶至今的十余年中，过氧化物还原酶越来越受到人们的广泛关注。过氧化物还原酶在体内主要是通过还原过氧化氢和一些过氧化氢物()来实现自己的抗氧化作用。过氧化物还原酶属于过氧化物酶家族。过氧化物酶的氢供体(hydrogen donor)目前发现的主要有谷胱甘肽、硫氧还蛋白、NADH、NADPH。过氧化物还原酶与其他过氧化物酶比较最明显的特征就是绝大部分的过氧化物还原酶在体内是以硫氧还蛋白作为唯一的氢供体。正因为如此，过氧化物还原酶也被称为硫氧还蛋白过氧化物酶(Thioredoxin Peroxidase，TPx)。但是并不是所有的过氧化物还原酶都是以硫氧还蛋白作为唯一氢供体。过氧化物还原酶普遍存在于多数生物体内。研究已经证明酵母、植物、动物、原生动物、寄生虫甚至真细菌和古细菌体内都含有该酶，说明过氧化物还原酶是一个非常重要的基因。过氧化物还原酶主要位于细胞溶质中，在线粒体、叶绿体、过氧化物酶体和细胞核内也均有少量分布。实验证明过氧化物还原酶在生物体内大量表达。许多生物体含有不止一种过氧化物还原酶的同型异构体。在哺乳动物细胞里至少已有六种过氧化物还原酶已经被发现。过氧化物还原酶在生物体内的主要功能包括两个方面一是细胞脱毒能力和抵抗氧化压力；二是调节由过氧化氢介导的信号转导和免疫反应。根据过氧化物还原酶所具有的活性半胱氨酸残基的数目可以把其分为两大类1-Cys和2-Cys过氧化物还原酶。从结构和反应机制的进一步研究得出的结果我们还可以把2-Cys过氧化物还原酶分为两类典型和非典型的2-Cys过氧化物还原酶。典型的2-Cys过氧化物还原酶，由于这一类酶在体内只依靠硫氧还蛋白作为它的唯一的氢供体，所以我们又将它称作硫氧还蛋白过氧化物酶(TPx)。研究表明，寄生虫的过氧化物还原酶在寄生虫抵抗宿主的免疫反应和氧化压力起着重要的作用；而在哺乳动物特别是人，该蛋白与疾病，信号传导和免疫反应有着紧密联系。随着对过氧化物还原酶研究的不断深入，人们越来越认识到它在生物体内的重要性。在寄生虫的防治和抗肿瘤抗衰老药物的研究中，该蛋白有着良好的前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新的中国青岛文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶基因及其编码的蛋白Bbt-TPx。本专利技术的另一目的在于提供上述基因的蛋白在制备抗肿瘤和抗衰老的药物中的应用。本专利技术用RT-PCR的方法，从中国青岛文昌鱼卵巢总RNA中分离得到的硫氧还蛋白过氧化物酶基因TPx，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。上述本专利技术基因编码的蛋白(重组文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶Bbt-TPx)，其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示；该蛋白等电点为7.30，分子量为22150道尔顿。该蛋白Bbt-TPx是通过表达载体pET-32a(+)M-TPx在大肠杆菌中以胞内可溶的形式表达的。所述表达载体pET-32a(+)M-TPx是在质粒pET-32a(+)M(购自Nobogen公司)的多克隆位点中间插入His的亲和标记位点和TPX基因序列的高效表达载体，该系统使TPx基因在大肠杆菌中以胞内可溶的形式表达，表达量可达600mg/L。本专利技术所选择的文昌鱼属于中国青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)，采自中国山东省青岛市沙子口水域。中国青岛文昌鱼卵巢cDNA文库的构建首先分离文昌鱼卵巢，提取总RNA。取总RNA进行逆转录合成cDNA第一链产物。再取cDNA用于连接反应，转化液分别涂板，其余用于摇总库菌落。从平板中挑取单克隆保种本专利技术通过对以上重组克隆大规模序列测定，从中得到了1个新的编码中国青岛文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶的克隆，命名为TPx(其DNA序列如序列表中<400>1序列所示)。新基因编码198个氨基酸的成熟肽(其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示)，等电点为7.30，分子量为22，150道尔顿，具有典型的硫氧还蛋白过氧化物酶一级结构的特征，分子内具有两个活性半胱氨酸功能域。本专利技术通过设计了一对引物，将编码中国青岛文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶的新基因TPx用PCR方法从T载体上扩增出来，克隆到原核融合表达载体pET-32a(+)M上，构建成表达质粒pET-32a(+)M-TPx，并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)/pLysS。此表达载体(pET-32a(+)M-TPx)以T7为启动子，以可溶的形式表达，其N端具有6×His结构，便于利用固定化金属配体亲和层析进行纯化。通过对培养时间，诱导时间，温度等条件的摸索和优化，重组Bbt-TPx蛋白的表达量可达到600mg/L，并且基本上处于可溶状态。本专利技术还摸索和优化了重组Bbt-TPx蛋白的纯化条件，表达产物的超声裂解液经Ni2+Chelating Sepharose亲和色谱层析，得到纯度较高的目的蛋白，目的蛋白经进一步的SP-Sepharose阳离子交换层析，可得到纯度在95％以上的重组Bbt-TPx蛋白。试验证明，本专利技术获得的重组文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶具有生物活性。该重组文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶具有抗氧化作用。重组文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶具有还原H2O2的活性。当超螺旋DNA或对硫醇基敏感的蛋白遭到外界的氧化作用破坏时，重组的Bbt-TPx蛋白对其具有明显的保护作用。因此，本专利技术的重组硫氧还蛋白过氧化物酶可用于制备抗肿瘤和抗衰老的药物。由本专利技术的含有文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶编码序列的表达质粒pET-32a(+)M-TPx经BaM HI/Xho I双酶切，可得到610bp的片段，即为文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶TPx编码序列。本专利技术的表达质粒的复制方法参照Sambrook(Sambrook，et al.1989，Molecular cloing.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)方法，按CaCl2法在E.Coli.DH5α或BL21(DE3)/pLysS菌株中转化质粒，用含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基转化细菌，碱法提取质粒。附图说明图1为本专利技术的文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶和其他物种的该蛋白的比较结果，其中加粗和阴影表示相同；加边框表示为该蛋白的功能域。图2为青岛文昌鱼硫氧还蛋白过氧化物酶基因TPx的PCR产物电泳结果。1TPx基因PCR产物本文档来自技高网...

【技术保护点】
用ＲＴ－ＰＣＲ的方法，从中国青岛文昌鱼卵巢总ＲＮＡ中分离得到的硫氧还蛋白过氧化物酶基因ＴＰｘ，其ＤＮＡ序列如序列表中〈４００〉１序列所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐安龙，廖剑，孙孜孜，王磊，董美玲，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]