地衣芽孢杆菌的突变宿主细胞制造技术

一种地衣芽孢杆菌突变体宿主细胞，其包含一或多个基因突变（缺失），所述基因编码具有蛋白水解活性的多肽，其中所述突变体宿主细胞表达的所述一或多种蛋白酶，比在等同条件下培养的亲代宿主细胞少至少５％。所述突变体宿主细胞用于制备异源多肽。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

芽孢杆菌(Bacillus sp.)是制备异源蛋白的感兴趣的宿主，因为它们能直接将蛋白分泌到培养基中。它们具有高的分泌蛋白的能力，且在遗传上是高度顺从的(amenable)，不致病的(nonpathogenic)，并且无内毒素。所以，在芽孢杆菌即在地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis，B.licheniformis)中已经高效制备并分泌了来自不同生物体(organisms)的多种蛋白。在高度竞争的生物技术产业，即使稍微改良(improved)的芽孢杆菌宿主细胞也是需要的，此宿主细胞能提供，例如从产品稳定性，产品纯度等上讲，更令人感兴趣的生产系统，或甚至只是可选的生产系统。
技术介绍
芽孢杆菌宿主细胞内可以以生物方式生产很多有商业效益的工业产品，例如异源多肽，氨基酸，碳水化合物等。然而，与芽孢杆菌生产型宿主细胞同源的(native to)污染性(contaminant)多肽也与所述产物一起产生，其中一些可被分泌到所述培养基，且其中一些可保留在细胞中或保持与细胞膜相连。此类污染物通常必须被去除(removed)或抑制，来确保例如，所述产物的稳定性或储藏期限(shelf-life)，或用来获得足够的产品纯度。在地衣芽孢杆菌中制备异源多肽，尤其会由于存在具有蛋白水解活性的污染性天然多肽而受影响。已经采用了不同方式来避开细胞外降解的问题，包括使编码已知蛋白酶的基因缺失(Sloma等，1989；Wu等，1991；Sloma等，1991)或在发酵过程中添加蛋白酶抑制物(Simonen&Pala，1993)。专利技术概述本专利技术要解决的问题是，如何提供一种改良的地衣芽孢杆菌宿主细胞，该细胞表达的一或多种具有蛋白水解活性的天然多肽减少。本专利技术提供一种解决此问题的办法，该方法通过鉴定数个来自地衣芽孢杆菌、具有蛋白水解活性、迄今为止仍未知的多肽，及编码它们的多核苷酸，来构建一个突变体宿主细胞，其表达的一或多种这些多肽和/或其紧密相关的同系物减少。因此，本专利技术一方面涉及，衍生自亲代地衣芽孢杆菌宿主细胞的地衣芽孢杆菌突变体宿主细胞，所述突变体宿主细胞在一或多个编码一或多种具有蛋白水解活性的多肽的基因上有突变，所述多肽与SEQ ID NO2到64(包括SEQ ID NO2和64)，或SEQ ID NO2到SEQ ID NO84(包括SEQ IDNO2和84)所示的一或多种多肽至少80％相同，优选至少85％相同，更优选至少90％相同，还更优选至少95％相同，最优选至少97％相同，其中所述突变体宿主细胞表达的一或多种具有蛋白水解活性的多肽比在等同条件(comparable conditions)下培养的亲代宿主细胞少至少5％。优选所述突变体宿主细胞表达的一或多种具有蛋白水解活性的多肽，比在等同条件下培养的亲代宿主细胞少至少10％，更优选少至少20％，还更优选少至少30％，还更优选少至少40％，还更优选少至少50％，或少至少60％，或少至少70％，或少至少80％，或最优选少至少90％。最优选，所述突变体宿主细胞绝对不表达一或多种具有蛋白水解活性的多肽。必须使用等同条件进行培养，来比较本专利技术的突变体宿主细胞和亲代宿主细胞中，所述一或多种具有蛋白水解活性多肽的表达水平。在等同条件下以相同设置(setup)分别培养它们，当然允许通常与生长实验相关的操作参数例如温度控制等的常规标准差。所述一或多种多肽的表达水平的定量是用本领域已知的标准教科书的实验技术，例如mRNA定量或基于免疫的(immuno-based)实验。本专利技术另一方面涉及，一种在地衣芽孢杆菌突变体宿主细胞中制备至少一种感兴趣的产品的方法，其包括在合适的培养基中培养上述方面限定的地衣芽孢杆菌突变体宿主细胞，在该培养基中产生所述产物。本专利技术最后一方面涉及，第一方面所限定的地衣芽孢杆菌突变体宿主细胞，在制备至少一种感兴趣的产品中的用途，其包含在合适的培养基中培养所述突变体宿主细胞，在该培养基中产生所述产物。定义核酸构建体(construct)本文所用术语“核酸构建体”指单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因或被修饰(modified)来以一种天然不存在的方式包含核酸片段(segment)。当所述核酸构建体包含表达本专利技术的编码序列所需的控制序列时，该术语核酸构建体与术语“表达盒(expression cassette)”同义。控制序列本文所限定的术语“控制序列”包括表达本专利技术的多肽所必需的或对其有利的所有组分。每个控制序列可以与编码所述多肽的核苷酸序列同源或异源。此控制序列包括但不限于，前导序列，多腺苷酸化序列(polyadenylation sequence)，前肽序列，启动子，信号肽序列，和转录终止子。所述控制序列至少包括启动子，以及转录和翻译终止信号。所述控制序列可以带接头，以引入特定限制酶切位点，来促使所述控制序列与编码多肽的核苷酸序列的编码区连接。可操作地连接本文限定术语“可操作地连接”为一种构型(configuration)，其中控制序列位于与所述DNA序列的编码序列相关的适当位置，从而所述控制序列可指导多肽的表达。编码序列本文所用术语“编码序列”包括核苷酸序列，它直接表明其蛋白产物的氨基酸序列。所述编码序列的边界通常由开放阅读框架来确定，它通常从ATG起始密码子开始。所述编码序列通常包括DNA，cDNA和重组的核苷酸序列。表达本文上下文中术语“表达”包括多肽生产涉及的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。表达载体本文上下文中术语“表达载体”包括线性或环状的DNA分子，其包含编码本专利技术多肽的片段，并且该片段可以可操作地连接到使其转录的其它片段上。
技术实现思路
一种地衣芽孢杆菌突变体宿主细胞，其衍生自亲代地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中所述突变体宿主细胞有一或多个基因发生突变，所述基因编码一或多种具有蛋白水解活性并且与SEQ ID NO2到SEQ ID NO64(包括SEQ IDNO2和64)，或SEQ ID NO2到SEQ ID NO84(包括SEQ ID NO2和84)中所示的一或多种多肽至少80％相同的多肽，其中所述突变体宿主细胞表达的所述一或多种具有蛋白水解活性的多肽，比在等同条件下培养的亲代宿主细胞少至少5％。本文上下文中术语“亲代宿主细胞”指，除了在所述突变体的一或多个编码一或多种具有蛋白水解活性的多肽的突变基因之外，与本专利技术子代(progeny)突变体或突变体细胞在遗传上(genetically)相同，或等基因的(isogenic)的细胞。多肽序列的同一性，或同一性(％)可通过用本领域已知的计算机程序进行序列比对来适当地研究，如GCG程序包提供的“GAP”(Program Manual forthe Wisconsin Package，Version 8，August 1994，Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S.B.and Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48，443-453)。使用如下设置用GAP来本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种地衣芽孢杆菌突变体宿主细胞，其衍生自亲代地衣芽孢杆菌宿主细胞，其中所述突变体宿主细胞有一或多个基因发生突变，所述基因编码一或多种具有蛋白水解活性并且与ＳＥＱＩＤＮＯ：２到８４所示的一或多种多肽至少８０％相同的多肽，其中所述突变体 宿主细胞表达的所述一或多种具有蛋白水解活性的多肽，比在等同条件下培养的亲代宿主细胞少至少５％。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：詹斯T安德森，斯蒂恩T乔根森，迈克尔D拉斯马森，彼得B奥尔森，伊布G克劳森，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]