本发明专利技术提供了在神经干细胞分化过程中有显著差异表达的ＮＭ＿０１７０８４．１基因；本发明专利技术也提供了用ＲＮＡｉ沉默该基因表达后促进了神经干细胞分化，并且在酶水平抑制该基因编码蛋白后得到同样的结论：该基因在神经干细胞分化过程中具有非常重要的作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程和发育生物学，涉及神经干细胞分化发育相关基因的遗传工程，以及利用RNA干扰等技术，以神经干细胞分化发育相关基因及其产物作为干预干细胞分化发育的靶标，从而调控神经干细胞分化发育。
技术介绍
神经干细胞是指具有分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的能力，并能进行自我更新、足以提供脑组织细胞的可再生细胞。在哺乳动物中枢神经系统发育，保持中枢神经系统的功能具有重要作用。神经干细胞分化是一个极为复杂的过程。影响神经干细胞分化的因子很多，如CNTF能促进神经干细胞分化为胶质细胞，而BDNF则促进分化为神经元。我们发现了神经干细胞分化过程中NM_017084.1基因的特异表达(见专利申请)。特异性干预这个基因表达的技术，对于研究这个基因的具体功能，以及特异性调控这个基因的表达，从而调节神经干细胞的发育、分化，非常重要。由于神经干细胞固有的体外分离培养困难的特点，目前对其所做的报道往往局限在分离培养技术上。专利技术概述本专利技术的目的在于证实NM_017084.1基因与神经干细胞分化有关。本专利技术的另一目的在于利用RNAi技术沉默该基因后对神经干细胞分化的影响。本专利技术包括下列步骤分离和培养神经干细胞；用Northern技术鉴定与神经干细胞分化相关的NM_017084.1基因，以该基因为模板合成与其同源的RNA，以这些合成的核酸片段干预神经干细胞的分化发育，研究调控的效果。另一方面NM_017084.1基因编码甘氨酸-N-甲基转移酶，利用该酶的底物S-腺苷高半光氨酸抑制甘氨酸-N-甲基转移酶，研究其对神经干细胞分化的影响。具体的包括以下的实施方案实施例材料与方法一、神经干细胞的分离培养和鉴定1.神经干细胞传代培养(未分化神经干细胞的培养)原代培养(培养液为基础培养液+20ng·mL-1的EGF和bFGF)一周后，收集细胞团，用枪头吹打成单细胞悬液，再用移液器将细胞悬液收集到50mL的离心管，1500rpm，5分钟，弃上清，然后用新鲜培养基悬浮细胞沉淀，用移液管转移的无菌的培养瓶内。观察结果发现在原代培养过程中第1天观察到细胞呈圆形亮点；第2、第3天可见有几个细胞形成的哑铃状形态，绝大多数单个细胞已贴壁，部分细胞有突起生成；第4、第5天可见到约几十个细胞的悬浮球形成，并且小型细胞团长成中型的细胞团第7天时细胞团进一步变大，悬浮神经球也明显增大且可以多次传代。2.分化神经干细胞的培养原代培养(培养液为基础培养液+20ng/mL的EGF和bFGF)两周后，收集细胞团，用枪头吹打成单细胞悬液，再用含10％胎牛血清的基础培养基培养两周。在神经干细胞的培养过程中，已加胎牛血清培养的实验组和未加胎牛血清的对照组在培养的前3天可以观察到细胞呈圆形。到第4天时，大部分细胞贴壁，并且部分细胞有突起生成，第7天后部分细胞团有突起形成，细胞团和单细胞相互交叉，出现突起交织成网状并且紧紧贴在培养瓶上。3.鉴定神经干细胞的间接免疫荧光细胞化学法(1)原理已知抗体或抗原用荧光素做标记物，检查细胞或组织标本上相应的抗原或抗体，在荧光显微镜下，由于抗原抗体特异性结合，结合部位的荧光素因受激发光照射而发出明亮的荧光。从标记物存在的位置和数量，可确定在组织细胞中的定位和分布。常见的标记荧光素有异硫氰酸(FITC)和四乙基罗丹明(RB200)，前者发出荧光波长为490-619纳米(黄绿色荧光)。后者发射荧光波长为540-660纳米(橙红色荧光)。FITC和RB200常用于标记免疫荧光蛋白Ig。(2)方法染色前一天，将细胞传代，种植到Poly-L-lysine包被的玻片上(Poly-L-lysine包被玻片的处理将载玻片置于0.5％的Hcl中，浸泡过夜，流水冲洗并用双蒸水清洗，高温灭菌，浸泡在多聚赖氨酸中并放于电热培养箱中2-3小时，去除多余多聚赖氨酸，并用0.01％PBS漂洗)。染色当天，取出待染细胞，PBS漂洗两次，用40g·L-1多聚甲醛固定15分钟，吸除固定液，PBS漂洗两次，边洗边轻轻振荡，用10mg·L-1BSA/3mg·L-1Triton×100封闭1小时，再加入一抗，常温下孵育90分钟，PBS漂洗三次，每次10分钟，除去未反应的非特异性吸附的抗体，减少背景染色。然后加入连有FITC荧光素的相应的二抗，孵育30分钟，弃二抗，PBS漂洗三次，每次10分钟，甘油明胶封片，荧光显微镜下观察。Nestin蛋白是神经干细胞的标志蛋白，通过免疫荧光单标染色证实了在采用无血清培养液的对照组中观察到大量Nestin的阳性细胞，细胞呈散状或重叠分布。二、总RNA提取、纯化及mRNA的分离1.用于提取总RNA的细胞培养无菌条件下取E14的SD大鼠的纹状体，机械法将组织吹打成单细胞悬液，以3×105mL-1的细胞浓度，将细胞种植在添加了20ng/mL EGF和10ng/mLbFGF的基础培养液I中，然后将装有培养液的培养瓶置于37℃，5％CO2的培养箱中培养。培养一周后，收集细胞团，用枪头吹打成单细胞悬液，然后重复上述操作3次后，将悬浮的神经干细胞团收集起来，一部分细胞用于提取总RNA，另一部分则吹打成单细胞悬液后，以同样的细胞密度种植在添加了20ng/mLEGF、10ng/mL bFGF和10％胎牛血清(FCS)的基础培养液I中，于37℃，5％CO2的培养箱中培养两周后，收集贴壁分化细胞提取总RNA。2.总RNA提取细胞计数，离心神经干细胞，然后加Trizol(若是悬浮细胞，约5～10×107个细胞中加1mL Trizol；若是贴壁细胞，约1mL Trizol/10cm2)，用枪头反复抽吸混匀，再加入糖原(终浓度250μg/mL)，剧烈振荡或匀浆器匀浆。等细胞裂解完全后将细胞裂解液转移至1.5mL的离心管中(每管中1mL)，加预冷氯仿/异戊醇200uL，振荡30秒，12000g，4℃离心5分钟，取出上清于另一试管中，加入等体积异丙醇于上清液中，振荡10秒，-20℃放置30分钟。12000g，4℃离心10分钟，弃上清(防止沉淀丢失)。用70％乙醇洗两次(每次12000g，4℃离心2分钟)，干燥，加0.1％DEPC水，-70℃下存放备用。3.总RNA的处理(去除少量基因组DNA)用不含RNA酶的DNA酶处理总RNA去除少量基因组DNA，具体方法如下在一灭菌的Eppendorf管中加入10×PCR buffer 5.0μL50mmol/L MgCl21.5μLRNasin 5.0UDNA酶I(RNase-Free) 4.5U总RNA 20μg加DEPC处理过所双蒸水至50μL→混匀→37℃，30分钟→加DEPC处理过的双蒸水至50μL→加酚/氯仿(3∶1)100μL→4℃，10000g，20分钟→转移上清，加等体积氯仿→4℃，10000g，20分钟→转移上清，加15μL 2mmol/L乙酸钠，250μL无水乙醇→-20℃，1小时→4℃，10000g，20分钟→75％乙醇洗沉淀一次→沉淀溶于20μL DEPC处理过的双蒸水中备用。4.RNA的鉴定及定量采用比色法和电泳法鉴定总RNA的质量①比色法上述RNA溶液经适当稀释(50～100倍)后于260nm和280nm波长处测吸光度(A)，求出A260/A280的值。②电泳法(1)凝胶的制本文档来自技高网...
【技术保护点】
一个与神经干细胞分化发育相关基因。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：文铁桥，李海龙，
申请(专利权)人：上海大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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